干細胞研究進展講稿

干細胞研究進展組胚：郭雨霽1981年Evans等成功地建立了小鼠的ESC系；1995年Thompson等建立了第一株靈長類動物的ESC系；1998年11月，美國威斯康星大學的科學家在美國《科學》雜志報告說，他們已成功地使人類胚胎干細胞在體外生長和增殖；1999年12月，干細胞研究進展被《科學》雜志評選為該年度世界十大科學進展之首;1999年12月，美國科學家在《美國科學院院刊》報告說，小鼠肌肉組織的成體干細胞可以“橫向分化”為血液細胞。隨后，世界各國的科學家相繼證實，成體干細胞，包括人類的成體干細胞具有可塑性;2001年末,干細胞研究又被其列為六大熱門科技領(lǐng)域之首;干細胞的話題沸沸揚揚地充斥在全球各種新聞媒體2001年4月，美國科學家發(fā)現(xiàn)，從病人臀部和大腿處抽取的脂肪中，含有大量類似干細胞的細胞，這些細胞可以發(fā)育成健康的軟骨和肌肉等。2006年兩項研究成果標志著干細胞技術(shù)正從一種概念，轉(zhuǎn)變成能夠看得見的事實：美國科學家利用胚胎干細胞所衍生的運動神經(jīng)元讓癱瘓的老鼠恢復了行走能力；英國科學家從胚胎干細胞中培育出來的精子，并使之與卵細胞結(jié)合，生育出幼鼠。2010年1月韓國《朝鮮日報》報道，韓國建國大學獸醫(yī)學院教授利用人類臍帶血干細胞成功治愈了脊髓受傷導致兩條后腿癱瘓的狗。分離和體外培養(yǎng)各種來源的干細胞的技術(shù)不斷成熟,更是引發(fā)了新一輪的干細胞研究熱潮。美國加州每年提供干細胞研究經(jīng)費達3億美元。我國的干細胞研究也很活躍，“863”計劃近期將為干細胞研究提供2億元人民幣的經(jīng)費。2000年日本啟動“千年世紀工程”，干細胞工程為核心技術(shù)的再生醫(yī)療成為這項工程的四大重點之一，第一年度投資金額達108億日元。到底干細胞是什么東西，為何會受到如此的關(guān)注？干細胞是潛力無窮？還是被我們過度期待？干細胞（stemcells）是一類能夠進行自我更新（self-renew）和尚未分化

（un-differentiated具有分化潛能）的細胞；可以分化為多種組成人體的組織或器官的細胞類型。自然存在的各種干細胞多能(pluripotent)干細胞(胚胎干細胞、胚胎生殖細胞)單能(unipotent)干細胞(成體干細胞)造血干細胞其他組織特異性干細胞（神經(jīng)、肺部干細胞等）特化細胞紅細胞血小板白細胞全能(totipotent)干細胞

(受精卵)Thefertilizedovumistheoriginofthelife.滋養(yǎng)層胎盤及胎兒的附屬結(jié)構(gòu)卵黃囊尾側(cè)壁上的內(nèi)胚層細胞是原始生殖細胞的發(fā)源地。后經(jīng)腸系膜遷移至生殖腺嵴。多能干細胞pluripotentstemcells：

a、來源：胚胎干細胞—內(nèi)細胞群細胞胚胎生殖細胞—原始生殖細胞

b、特點：可進行克隆性增殖而不發(fā)生分化，保持二倍體核型不變；具有多向分化的潛能，在特定條件下可誘導分化為三個胚層來源的所有組織細胞；失去了發(fā)育形成生物個體的能力。

c、多分化潛能性的實驗證據(jù)：嵌合體實驗畸胎瘤實驗類胚體實驗單能干細胞unipotentstemcells：

成體干細胞/組織特異性干細胞

a、特征：能自我復制,有分化潛能,但只能分化為所在組織的功能細胞。

b、存在部位：骨髓,周圍血液,腦,脊髓,血管,骨骼肌,表皮,

消化管,角膜,視網(wǎng)膜,肝,胰等

c、可塑性：橫向分化

特化細胞specializedcells：

具有特定形態(tài)結(jié)構(gòu)、分子標記和功能，不能進行分化。橫向分化：通常情況下，供體的干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。部分干細胞在特定條件下可以轉(zhuǎn)化為其它胚層來源的細胞，如肌肉干細胞在特定條件下可以分化為各種血細胞等。1999年Goodell等人分離出小鼠的肌肉干細胞，體外培養(yǎng)5天后，與少量的骨髓間質(zhì)細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細胞會分化為各種血細胞。ESC和成體干細胞的異同相同點：都具有干細胞的自我復制和分化能力，都有“歸巢”現(xiàn)象。干細胞是一類能夠進行自我更新和具有分化潛能的細胞（具有分裂增殖能力，干細胞本身不是處于分化途徑的終端）。干細胞通過兩種方式生長*對稱分裂---形成兩個相同的干細胞*不對稱分裂---由于細胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，使得一個子細胞不可逆的走向分化的終端成為功能專一的分化細胞；另一個保持親代的特征，仍作為干細胞保留下來。干細胞的共同特征干細胞增殖的緩慢性干細胞增殖的自穩(wěn)性區(qū)別于腫瘤細胞的本質(zhì)性特征。有利于其對特定的外界信號做出反應，以決定是進入增殖還是進入分化程序，同時有利于減少干細胞內(nèi)基因突變的危險。

研究干細胞增殖和分化機制的最終目的是應用干細胞治療疾病。理論上講，干細胞可以用于許多疾病的治療，像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。就是干細胞的這種潛在的價值引起了各國學者的研究興趣。干細胞的應用胚胎干細胞embryonicstemcells

干細胞相關(guān)技術(shù)：克隆clone

轉(zhuǎn)基因技術(shù)transgenictechnology成體干細胞：神經(jīng)干細胞neuralstemcells

肺干細胞pulmonarystemcells誘導型多能干細胞inducedpluripotentstemcell主要內(nèi)容第2周第3周胚胎干細胞（embryonicstemcell,ESC）是從早期胚胎的內(nèi)細胞團中分離出來的一種高度未分化、具有多向分化潛能的細胞。1981年Evans等從囊胚的內(nèi)細胞群中成功分離、建立了小鼠的ESC系1998年Thomson和Gearhart分別用胚泡內(nèi)細胞團細胞和原始生殖細胞成功地建立了人的ESC系

在全球范圍內(nèi)掀起了ESC的研究熱潮。胚胎干細胞

ESC的體外培養(yǎng)建系定向誘導分化在生物醫(yī)學上的應用早期小鼠胚胎的獲得：

受精后第4天上午，取出孕子宮，將輸卵管端夾閉，由陰道端插入5號針頭注入沖胚液，至宮腔達到一定壓力，突然松開輸卵管側(cè)，即可獲得發(fā)育至囊胚期的早期胚胎。選取發(fā)育良好的囊胚接種在飼養(yǎng)層細胞上。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESC子宮小鼠早期胚胎的體外培養(yǎng)---飼養(yǎng)層：飼養(yǎng)層細胞的作用：

培養(yǎng)的鼠胚成纖維細胞經(jīng)絲裂霉素C處理后，可用作飼養(yǎng)層細胞。飼養(yǎng)層細胞經(jīng)絲裂霉素C處理后，雖然失去分裂能力，但仍然保持生存活性，并為胚胎干細胞的存活、增殖和未分化狀態(tài)的維持提供一些必需因子，還可去除培養(yǎng)環(huán)境中的毒素和代謝抑制因子。飼養(yǎng)層細胞的處理方法如下：

取P12-16的孕鼠，剖腹取胚胎，去除頭、四肢、內(nèi)臟后，Hanks液反復沖洗，剪碎鼠胚組織，胰酶消化成單細胞懸液，接種，即為原代培養(yǎng)鼠胚成纖維細胞。將原培養(yǎng)液棄去，加入含10μg/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)液作用2-4h，然后胰酶消化制成單細胞懸液，接種在四孔板中備用。

從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESC小鼠早期胚胎的體外培養(yǎng)：從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESCESC的分離培養(yǎng)：

待小鼠囊胚貼壁，并從透明帶中孵出后，在顯微操作儀下分離內(nèi)細胞團，吸出內(nèi)細胞團，用胰酶消化，將其離散成小的細胞團塊，接種于新的鋪有飼養(yǎng)層細胞的四孔板中。一周后即可出現(xiàn)ESC集落。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESCESC的分離培養(yǎng)---飼養(yǎng)層：

ESC體外培養(yǎng)的條件非常嚴格，為了維持ESC的未分化狀態(tài)，在體外培養(yǎng)過程中，必須有飼養(yǎng)層或其它分化抑制劑的支持，適宜的飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系是ESC體外培養(yǎng)擴增的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESC原代鼠胚成纖維細胞（primarymouseembryonicfibroblast，PMEF）以其易于取材、分化抑制效果好等特點而被廣泛應用。目前常用的飼養(yǎng)層有：STO（SIM小鼠成纖維細胞株，并為抗硫代鳥嘌呤6-thioguanine和鳥本箭毒素甙鳥巴因oualiain選擇過的細胞）、PMEF(原代培養(yǎng)鼠胚成纖維細胞)、SNL(G418R基因和LIF基因轉(zhuǎn)染的STO）、HBC-5637等。隨著對人ESC研究的深入，來源于人ESC的組織器官可望用于臨床。在體外培養(yǎng)人ESC時多使用PMEF作為飼養(yǎng)層，這樣在ESC用于臨床治療時，可能帶來鼠源性蛋白的污染而引起不良反應，所以有人嘗試利用人胚胎成纖維細胞作飼養(yǎng)層進行人ESC的培養(yǎng)，并已有成功的報道。

飼養(yǎng)層細胞的抑分化功能來源于基質(zhì)中的白血病抑制因子（leukemiainhibitingfactor,LIF），LIF最早于1988年在小鼠KrebsⅡ腹水瘤細胞條件培養(yǎng)基中被純化的，是一種典型的多功能細胞因子。如：抑制骨髓白血病

m1細胞的增殖，誘導其向巨噬細胞方向分化；促進外周膽堿能神經(jīng)分化和功能成熟；刺激破骨細胞增殖；調(diào)節(jié)肝細胞急性期反應蛋白的合成；抑制多能胚胎干細胞的分化等。

有學者向ESC培養(yǎng)基中加入LIF以取代飼養(yǎng)層細胞，輔以條件培養(yǎng)基即可維持ESC的多能性，從而消除飼養(yǎng)層細胞的干擾。

ESC的純化：

待四孔板內(nèi)長滿ESC集落，未出現(xiàn)分化征象之前，用玻璃針挑取ESC集落，用胰酶消化，反復吹打離散后重新接種。集落呈克隆狀生長，與飼養(yǎng)層細胞之間有明顯的界限，細胞排列緊密，界限不清，可見折光性比較強的分裂相。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESCESC特異性表面標記從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESCESC的鑒定---嵌合體制備技術(shù)：嵌合體（chimera）是指由兩種或兩種以上不同遺傳構(gòu)成的細胞構(gòu)成的個體，這種個體的組織器官由基因型不同的細胞群組成。ESC能廣泛參與宿主各組織的形成，尤其是生殖系的形成，成為嵌合體制備的最佳實驗材料。嵌合體的成功制備也是證明ESC具有發(fā)育全能性的一個金指標。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESC嵌合體動物的制備方法主要有三種：融合法、顯微注射法和共培養(yǎng)法。

融合法是指將來源于不同品系動物的早胚消化去透明帶后，在融合劑（多用植物血球凝集素）的作用下，形成融合胚。實驗過程中，由于消化劑、融合劑的使用，會對胚胎造成不同程度的損傷，所以融合法制備嵌合胚的成功率較低。共培養(yǎng)法是將著床前的早期胚胎與ESC進行共培養(yǎng)而獲得嵌合胚的一種方法。雖然有資料表明，粘附在早期胚胎滋養(yǎng)層外面的ESC，經(jīng)過過夜培養(yǎng)，能有效的與宿主ICM細胞整合，但是在共培養(yǎng)過程中，很難控制發(fā)生整合的ESC的數(shù)目，因此也限制了其使用。顯微注射法應用最為廣泛。通過顯微注射法構(gòu)建嵌合體是一項復雜的技術(shù)，ESC本身的特性、受體胚胎的品系來源以及顯微注射的熟練程度等都會直接影響嵌合體的獲得。第一部分C57BL/6JinbredmiceKMoutbredmiceEScellcultureSingle–cellsuspension5-10ESCmicromanipulatorreimplantationchimeraspseudopregnantfostermother(KM)

ESC的鑒定---嵌合體制備技術(shù)的應用：

目前，嵌合體制備技術(shù)已廣泛應用于發(fā)育生物學、神經(jīng)生物學、遺傳學、腫瘤學、毒理學等眾多研究領(lǐng)域，在當今生物醫(yī)學研究中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。在制備嵌合體之前，可以對ESC進行基因操作，獲取一些優(yōu)良性狀，利用基因操作成功的ESC進行嵌合體的制備，如果出現(xiàn)生殖系嵌合，就可以把優(yōu)良性狀遺傳下去。在家畜品種改良方面有廣泛的應用。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESC人胚胎著床前的發(fā)育過程：從人囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESCtotipotencypluripotencyESC的誘導分化：

細胞分化celldifferentiation：在個體發(fā)育中，由一種相同的細胞類型經(jīng)細胞分裂后逐漸在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定性差異，產(chǎn)生各不相同的細胞類群的過程。誘導induction：胚胎中的一個區(qū)域影響另一個區(qū)域，使其沿一條新途徑進行分化；某些環(huán)境因子的刺激使基因進入轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。

ESC的誘導分化：胚胎干細胞在外界因素的刺激下逐漸發(fā)育為具有特殊形態(tài)和功能的專一細胞的過程。ESC的誘導分化干細胞移植治療ESC分化形成的功能細胞就可以用于替代病變的功能細胞來行使功能。目前，在體外通過加入一些誘導劑或細胞因子進行誘導分化實驗，還很難模擬體內(nèi)的正常分化過程，任何一個誘導體系都不能保證誘導ESC定向分化為某一類型細胞，只能使某種類型的細胞趨于優(yōu)勢。ESC的誘導分化ESC的誘導分化ESC誘導分化的常用方法:

1.

加入誘導細胞分化的因子或化學物質(zhì)，如VGEF、

bFGF、DMSO和RA等

2.

將ESC與特定的細胞共培養(yǎng)

3.

將某種分化誘導因子的基因轉(zhuǎn)入ESC內(nèi)

ESC的誘導分化ESC的神經(jīng)誘導：

1.維甲酸（retinoicacid，RA）誘導：

維甲酸是維生素在體內(nèi)的活性衍生物,是一種很強的分化誘導劑,它可誘導類胚體分化成多種細胞類型,其分化方向取決于維甲酸的作用階段及劑量。

RA進入靶細胞后，由CRABP運送至細胞核，與核受體（RAR和RXR）結(jié)合。RXR自身或者與其他受體結(jié)合成同二聚體或異二聚體,識別DNA上維甲酸反應元件(RARE或RXRE),調(diào)控靶基因的表達，發(fā)揮重要的生物學效應，如調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和程序化死亡等。ESC的誘導分化1982年Jones-Willeneuve首次報道將RA運用于胚胎癌細胞（P19）向神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的誘導,在24-48h內(nèi)有神經(jīng)樣細胞移出。

Jones-VilleneuveEM,McBurneyMW,RogersKA,KalninsVI.Retinoicacidinducesembryonalcarcinomacellstodifferentiateintoneuronsandglialcells.JCellBiol.1982Aug;94(2):253-62.1995年Bain等人提出的“八日誘導程序”，即“4-/4+法”，是最經(jīng)典的RA誘導法。他們將未分化的小鼠ES吹散，懸浮培養(yǎng)4天形成類胚體，再向培養(yǎng)液中加入0.5μMRA，培養(yǎng)4天，發(fā)現(xiàn)有38%的神經(jīng)元樣細胞。

BainG,KitchensD,YaoM,HuettnerJE,GottliebDI.Embryonicstemcellsexpressneuronalpropertiesinvitro.DevBiol.1995Apr;168(2):342-57.在胚胎細胞的正常分化過程中，誘導過程的實現(xiàn)不僅依賴于誘導物的誘導作用，同時也依賴于被誘導細胞的反應性，還有賴于兩者之間在時間上和空間上的協(xié)調(diào)同步，這樣才能保證被誘導細胞定向地分化為某種類型的細胞。2.序貫誘導法：2000年Lee等使用“五步法”序貫誘導小鼠ESC向神經(jīng)細胞分化。擴增未分化的ESC；去除促有絲分裂素或分化抑制劑，懸浮培養(yǎng)，形成類胚體;去除生長因子，促分化，篩選nestin陽性細胞；擴增神經(jīng)前體細胞；利用神經(jīng)元促存活因子誘導并維持特定譜系神經(jīng)元成熟。3.

神經(jīng)分化的內(nèi)定模式（defaultmodel）：

在對脊椎動物神經(jīng)發(fā)育的研究中，有人發(fā)現(xiàn)外胚層細胞在無外界誘導信號下自發(fā)分化為神經(jīng)細胞。經(jīng)典的例子：Tropepe等人的實驗發(fā)現(xiàn)，低密度、無血清、無飼養(yǎng)層的小鼠ESC培養(yǎng)7天后有0.2%左右的細胞可聚集形成神經(jīng)球，其中82%的細胞呈nestin陽性著色。證明ESC能夠自發(fā)分化為神經(jīng)元。神經(jīng)分化的內(nèi)定模式認為在胚體原基中，神經(jīng)譜系的分化受著某種抑制信號的控制，神經(jīng)分化是抑制信號撤除后自發(fā)獲得的一種狀態(tài)。有資料表明：BMP4與這種抑制信號的轉(zhuǎn)導密切相關(guān)，使用BMP4的拮抗劑Noggin、Chordin可抑制這種抑制信號的傳導，從而促進ESC的神經(jīng)分化。4.基因修飾：將神經(jīng)特異性基因轉(zhuǎn)染入ESC，篩選即可得到高純度的神經(jīng)細胞。將Nestin（神經(jīng)前體細胞標志物）與報告基因增強性綠色熒光蛋白共同轉(zhuǎn)染入ESC，篩選可得到高純度的神經(jīng)前體細胞。將促多巴胺能神經(jīng)元生成的轉(zhuǎn)錄因子Nurr1轉(zhuǎn)染入ESC，即可得到

Nurr1ESC系，再通過五步序貫誘導法，即可得到50%多巴胺能神經(jīng)元，成為帕金森氏病細胞移植治療的一個新的細胞來源。隨著對神經(jīng)發(fā)育分子機制的逐步了解，越來越多的與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的基因被定位，這將為轉(zhuǎn)染干細胞的研究提供更準確、有效的靶基因信息，前景非常誘人。但是由于基因修飾導致的基因組不穩(wěn)定，導入基因可能引起的異?；虻谋磉_，都需要學者進行進一步研究。哺乳動物的發(fā)育均需由1個全能細胞(受精卵)分化形成200多種不同類型的細胞。從囊胚期內(nèi)細胞群分離得到的ESC在體外也具有無限或較長期的自我更新能力，并能在特定的誘導條件下分化為各種組織特異性細胞。

干細胞的調(diào)控是指給予適當?shù)囊蜃訔l件，對干細胞的增殖和分化進行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。內(nèi)源性調(diào)控外源性調(diào)控基因調(diào)控---干細胞應用的基礎哺乳動物的發(fā)育均需由1個全能細胞(受精卵)分化形成200多種不同類型的細胞。從囊胚期內(nèi)細胞群分離得到的ESC在體外也具有無限或較長期的自我更新能力，以及強大的分化潛能，能在特定的誘導條件下分化為各種組織特異性細胞。而且干細胞的增殖分化是可以受基因以及細胞外基質(zhì)調(diào)控的。干細胞增殖分化的可調(diào)控性為干細胞帶來了廣闊的應用前景。理論上講，干細胞可以用于許多疾病的治療，像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭、血液系統(tǒng)疾病等。就是干細胞的這種潛在的價值引起了各國學者的研究興趣。細胞替代治療制備轉(zhuǎn)基因動物ESC的應用---細胞替代治療：

最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死，退行性病變?nèi)缗两鹕C合征，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病、白血病等。

ESC的應用ESC移植治療的模式圖

ESC技術(shù)+轉(zhuǎn)基因技術(shù)隨著對個體發(fā)育分子機制的逐步了解，越來越多的與組織發(fā)生相關(guān)的基因被定位，這將為轉(zhuǎn)染干細胞的研究提供更準確、有效的靶基因信息，實現(xiàn)相對定向誘導分化，前景非常誘人。

但是由于基因修飾導致的基因組不穩(wěn)定，導入基因可能引起的異?；虻谋磉_，都需要學者進行進一步研究。源于胚胎干細胞的細胞已能或可能治療許多疾?。荷窠?jīng)細胞心肌細胞B型胰島細胞軟骨細胞白細胞皮膚細胞肝細胞骨細胞視細胞骨骼肌細胞帕金森病心肌梗死糖尿病骨關(guān)節(jié)炎白血病燒傷和創(chuàng)傷肝炎骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)膜退化肌營養(yǎng)不良治療ESC的應用利用ESC移植治療疾病確實具有廣泛的應用前景，但是胚胎干細胞通常取自4-5天的早期胚胎，在分離過程中不可避免會損毀所使用早期胚胎，因此該項研究在歐美受到了社會倫理學的制約，并且在實際應用中還不能避免免疫排斥。核移植技術(shù)逐漸引起各國學者的關(guān)注。人們可望通過核移植技術(shù)獲得雜合細胞發(fā)育成的囊胚，獲得多能干細胞，然后將這些細胞回輸入體內(nèi)，從而達到治療的目的。

核移植技術(shù)核移植技術(shù)

1938年,SpemanH在《EmbryonicDevelopmentandInduction》一書中提出了將分化了的細胞核移入去核卵細胞中看其是否能指導胚胎發(fā)育的異想天開的設想。

1952年,BriggsR和KingT通過移植蛙的胚胎細胞核到去核的卵子中得到發(fā)育正常的蝌蚪。

1981年,IllmenseeK和HoppePC聲稱通過核移植技術(shù)獲得成活的小鼠。

1997年,WilmutI用成體乳腺細胞核移植克隆羊成功，“多莉”羊的出現(xiàn)震驚了世界,也使克隆clone一詞成為家喻戶曉的詞匯。核移植技術(shù)困難重重克隆羊多莉Dolly的誕生

個體克隆羊多莉Dolly：

1997年2月22日，英國生物遺傳學家維爾穆特成功地克隆出了一只羊?？寺⊙颉岸嗬颉钡恼Q生震驚了世界?！岸嗬颉笔鞘澜缟系谝焕皿w細胞--乳腺上皮細胞，通過細胞核移植技術(shù)，得到的一只小綿羊。

多莉羊的誕生揭示一個全新概念：由成年機體的一個體細胞核，可以復制一個基因完全相同的新生命個體?？寺『镒覶etra：

2000年，美國俄勒岡地區(qū)靈長類動物研究中心的研究小組最近在著名的《科學》雜志上發(fā)表了他們克隆獼猴的成果。

克隆人的成功：

2002年12月克隆公司Clonaid法國成員BrigitteBoisselier表示，世界上第一個復制嬰兒誕生。

2003年1月意大利婦科醫(yī)生SeverinoAntinori稱有復制人的婦女將生下嬰兒。2009年3月，法新社報道，他已“制造”出3名“克隆人”，如今已有9歲。

牛,豬,馬,騾子,貓,狗,兔等動物相繼被克隆。帶來世人的驚慌此項研究用了約434個卵子,獲得277個重構(gòu)卵,移植到中間受體6

后，沖出247個胚胎,其中發(fā)育到桑椹胚和囊胚的29個(11.7%)

。把29個胚胎移植給13只代母，最后生出1只“多莉”,產(chǎn)羔率僅為3.4%

。若以重構(gòu)卵數(shù)計算,產(chǎn)羔率低于4‰。

克隆個體存在缺陷：被克隆動物即使能夠出生，仍會有嚴重的不正常變異，巨大，壽命短表面上看起來正常的動物，也存在異常的基因表達模式發(fā)育過程中各階段都會存在失控（epigeneticdysregulation）治療性克隆在中國

“治療性克隆”課題被列為國家級重點基礎研究項目。此課題分為上、中、下游三塊：上海市轉(zhuǎn)基因研究中心成國祥教授負責上游研究上海第二醫(yī)科大學盛惠珍教授和曹誼林教授分別主持中、下游的研究工作。其整體目標是，用病人的體細胞移植到去核的卵母細胞內(nèi)，經(jīng)過一定的處理使其發(fā)育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干細胞，在體外進行誘導分化成特定的組織或器官，如皮膚、軟骨、心臟、肝臟、腎臟、膀胱等，再將這些組織或器官移植到病人身上，從根本上解決同種異體器官移植過程中最難解決的免疫排斥反應。組織工程“人耳鼠”的制備：先用一種高分子化學材料聚羥基乙酸做成人耳的模型支架，讓細胞在這個支架上繁殖生長，然后，在裸鼠的背上割開一個口子，將已經(jīng)培養(yǎng)好的“人耳”植入后縫合?！叭硕敝Ъ茏詈髸约航到庀?，于是，“人耳”便與老鼠渾然成為一體。干細胞為組織工程提供了一種很好的種子細胞。ESC的應用---轉(zhuǎn)基因動物的制備：

外源目的基因的制備；外源目的基因的導入（受精卵或ESC）；轉(zhuǎn)基因胚胎移植；篩選轉(zhuǎn)基因動物品系。外源目的基因的制備--

利用限制性核酸內(nèi)切酶，從基因組中獲取目的基因；利用RNA合成cDNA；人工體外合成DNA片段；

PCR擴增特定基因片段。

轉(zhuǎn)基因動物的應用領(lǐng)域主要有：疾病的動物模型：尤其是單基因遺傳病。用于研究疾病的發(fā)病機理、藥物篩選、藥物治療、毒物測試；通過導入或剔除基因（knock-inorknock-out）來研究基因的功能、調(diào)控和發(fā)育，如癌基因、發(fā)育基因等；生物反應器：藥用或食品蛋白的大量生產(chǎn)，即轉(zhuǎn)基因動物制藥；異種器官的移植；家畜品種的改良。

轉(zhuǎn)基因動物的應用冠脈搭橋術(shù)后注意事項

2017.01.08

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，指冠狀動脈粥樣硬化，造成血管壁增厚，官腔狹窄或阻塞造成心肌缺血缺氧，甚至壞死而引起的心臟病，簡稱“冠心病”。

一、發(fā)生因素:

1.血脂異常:

總膽固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白或極低密度脂蛋白增高，高密度脂蛋白降低。2.高血壓:患此病的機率增高2-6倍，患此病者60%-70%有高血壓。3.吸煙4.糖尿病5.肥胖6.其他:缺少活動，家族史，A型性格等。二、臨床表現(xiàn):

1.心絞痛

2.心肌梗塞

3.缺血性心臟病

三、治療方法:

1.藥物治療:

擴冠，抗凝，控制血壓，血糖，強心利尿

2.再灌注治療:

溶栓治療，介入療法，冠狀動脈搭橋術(shù)冠狀動脈搭橋術(shù):

是讓心臟搏出的血升主動脈經(jīng)過所架的血管橋，流向冠狀動脈狹窄病變的遠端，從而恢復缺血心肌的正常供血，這種