135Hz極低頻電磁場(chǎng)對(duì)Hep-G

135Hz極低頻電磁場(chǎng)對(duì)HepG【摘要】目的：觀察135Hz極低頻電磁場(chǎng)照射對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響.方法：用MTT比色法、流式細(xì)胞儀，檢測(cè)經(jīng)135HzELF照射6,12,24h后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的活性、細(xì)胞周期、凋亡細(xì)胞的比例，并用掃描電鏡以及透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化.結(jié)果：ELF磁場(chǎng)暴露后，與相應(yīng)對(duì)照組相比其A值均下降，細(xì)胞活性隨照射時(shí)間延長(zhǎng)而下降；使HepG2細(xì)胞G1期阻滯，凋亡率隨照射時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高.掃描電鏡以及透射電鏡觀察到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞幾種特殊的形態(tài)學(xué)特征：凋亡細(xì)胞收縮，出泡，質(zhì)膜及細(xì)胞器保持完整.染色質(zhì)濃縮于核膜，最后，細(xì)胞解離成凋亡小體.結(jié)論：135Hz的ELF照射抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡.

【關(guān)鍵詞】極低頻電磁場(chǎng)；細(xì)胞凋亡；HepG2細(xì)胞

0引言

手提電話、計(jì)算機(jī)等家用電器方便人們生活的同時(shí)所產(chǎn)生的極低頻電磁場(chǎng)(ELF)越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注.如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，成為治療腫瘤的主要研究思路之一［2］.Simko等［3］報(bào)道ELF持續(xù)照射可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡.研究表明細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［4］，胞內(nèi)高濃度的Ca2+可以激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［5］.我們采用流式細(xì)胞儀技術(shù)、MTT法、掃描電鏡以及透射電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞活性、凋亡率及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測(cè).

1材料和方法

材料

人肝癌HepG2細(xì)胞，由病理教研室隋延仿教授惠贈(zèng).主要試劑：10mL/L四氧化鋨，丙酮，EPON812，乙腈，醋酸雙氧鈾.主要儀器：流式細(xì)胞儀，JEE4X真空蒸發(fā)儀，JFC1100離子濺射儀，S520掃描電子顯微鏡，LKBNova超薄切片機(jī)，JEM2000EX透射電子顯微鏡.

方法

G2細(xì)胞培養(yǎng)將HepG2細(xì)胞按照×108/L密度接種于帶孔的培養(yǎng)皿以及培養(yǎng)瓶中，以完全培養(yǎng)基(10mL/L胎牛血清，青、鏈霉素1×105U/L)送入50mL/LCO2的培養(yǎng)箱，37℃常規(guī)培養(yǎng).

實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞隨機(jī)分為6組，實(shí)驗(yàn)組為3組，分別是6,12,24h照射組；對(duì)照組為3組，分別是6,12,24h對(duì)照組，對(duì)照組置于37℃孵箱中.

照射將HepG2細(xì)胞放入XFDS超低頻信號(hào)發(fā)生器中的TEM小室℃，并保持恒溫.將頻率調(diào)至135Hz，電場(chǎng)強(qiáng)度為80V/m，分6,12,24h,37℃進(jìn)行輻照.

法檢測(cè)細(xì)胞活性將HepG2細(xì)胞均勻接種于96孔板，每組10個(gè)樣本，細(xì)胞密度為1×107/mL，分別照射6,12,24h后實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組棄去培養(yǎng)液，96孔板每孔加入MTT20μL,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清液，每孔加入150μL二甲亞砜，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，選取A490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)各孔A值.

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡率①分別將6,12,24h照射組及對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的HepG2細(xì)胞消化，吹打成單細(xì)胞懸液；②將單細(xì)胞懸液在室溫條件下離心，1400r/min離心5min后棄上清；③用冷PBS液洗滌一次；④將細(xì)胞以1×109/L的濃度重新懸浮于700mL/L的乙醇中室溫下固定30min，PI染色；待測(cè)細(xì)胞凋亡率的活細(xì)胞用膜聯(lián)素V試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，CouterELITEESP型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡率.

掃描電鏡觀察①制備細(xì)胞爬片：將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于含12mm×12mm蓋玻片的培養(yǎng)板中，密度為4×108/L，常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，135HzELF照射24h;mol/LPBS洗，5min×2次，30mL/L戊二醛固定30min,mol/LPBS洗，5min×2次；4℃保存待用.②樣品制備：將爬片依次經(jīng)乙腈梯度脫水；真空干燥儀干燥，噴金，掃描電鏡下觀察.

透射電鏡觀察①樣品制備：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組的細(xì)胞制成懸液，離心成1mm3細(xì)胞團(tuán)，加入30mg/L戊二醛，4℃固定2h以上，mol/LPBS漂洗，5min×2次；10g/L鋨酸后固定2h,mol/LPBS漂洗，5min×2次；丙酮梯度脫水，浸透；Epon812包埋，65℃聚合24h.制備50nm超薄切片，電子染色；②透射電鏡下觀察.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行析因設(shè)計(jì)方差分析，組間兩兩比較用LSDt檢驗(yàn)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

G2細(xì)胞正常對(duì)照組之間A值差別不大，照射6,12,24h組與相應(yīng)對(duì)照組有明顯差異.135Hz的ELF作用細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞周期發(fā)生了改變，凋亡率升高(Tab2).表1135HzELF對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響表2細(xì)胞周期及凋亡率比較

電鏡觀察正常對(duì)照組細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，核分裂相常見，細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，符合腫瘤細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn).照射24h，細(xì)胞收縮，變圓，細(xì)胞表面出現(xiàn)大小不等的泡狀隆起.透射電鏡下，①6,12,24h的正常對(duì)照組細(xì)胞呈圓形或橢圓型，體積大小不等，異型性明顯，細(xì)胞表面微絨毛豐富，細(xì)胞之間可見橋粒連接，符合腫瘤細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn).②6h照射組，少量細(xì)胞變圓，表面微絨毛減少，部分細(xì)胞表面出泡，線粒體濃縮，部分滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞漿及染色質(zhì)發(fā)生濃縮，核膜腔輕度擴(kuò)張，異染色質(zhì)增多，發(fā)生邊集.③12h照射組，部分細(xì)胞胞漿內(nèi)輕度泡狀隆起突出于細(xì)胞表面，胞漿及部分線粒體濃縮，異染色質(zhì)邊集.④24h照射組，胞漿及染色質(zhì)濃縮，分解成大小不等，形態(tài)不一的有膜包繞的團(tuán)塊，突出于細(xì)胞表面，團(tuán)塊脫落形成凋亡小體.

3討論

細(xì)胞增殖調(diào)控與腫瘤發(fā)生的密切關(guān)系已被人們所認(rèn)識(shí).關(guān)于ELF是否影響正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的增殖、分化無(wú)疑成為研究的熱點(diǎn)［6，7］.我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中，應(yīng)用透射電鏡觀察135Hz的ELF照射HepG2細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化，表明這種照射可抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡.

細(xì)胞發(fā)生凋亡有其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特征［8,9］：亞細(xì)胞水平上，染色質(zhì)濃縮，核裂解，核膜完整.胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張.隨著凋亡的進(jìn)一步發(fā)展，染色質(zhì)沿核膜聚集成塊，擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞膜卷曲，分別包繞各種細(xì)胞器和細(xì)胞核的染色質(zhì)，并以出芽的方式使細(xì)胞發(fā)生碎裂，形成凋亡小體.本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到了135Hz的ELF照射所引發(fā)的HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，但考慮到體外實(shí)驗(yàn)的局限性，135Hz的ELF的這一作用尚需在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證.

我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在所用的實(shí)驗(yàn)條件下，低頻電磁場(chǎng)的生物學(xué)效應(yīng)：在細(xì)胞水平上，表現(xiàn)為抑制HepG2細(xì)胞的增殖；在染色體DNA水平上，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞周期的影響，使細(xì)胞S期百分比降低，使細(xì)胞組滯于G1期.可以認(rèn)為，135Hz的ELF可能是通過(guò)改變HepG2細(xì)胞的周期從而影響細(xì)胞增殖的［24］.本實(shí)驗(yàn)中也同時(shí)觀察到低頻電磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，低頻電磁場(chǎng)作用以后，HepG2細(xì)胞的凋亡比率增高，說(shuō)明135Hz的ELF促進(jìn)了細(xì)胞凋亡.增殖與凋亡是對(duì)立而統(tǒng)一的整體，細(xì)胞群體表現(xiàn)出來(lái)的生長(zhǎng)減低的效應(yīng)，應(yīng)該是細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制與細(xì)胞凋亡的綜合體現(xiàn).135Hz的ELF能抑制HepG2細(xì)胞增殖的部分原因可能是促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡.

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