熒光定量技術和常見問題詳解演示文稿

熒光定量技術和常見問題詳解演示文稿本文檔共108頁；當前第1頁；編輯于星期三\16點15分（優(yōu)選）熒光定量技術和常見問題本文檔共108頁；當前第2頁；編輯于星期三\16點15分熒光定量PCR是什么一種實時監(jiān)控目的基因PCR擴增的技術本文檔共108頁；當前第3頁；編輯于星期三\16點15分定量PCR是如何工作的?傳統(tǒng)PCR

具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer緩沖液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA本文檔共108頁；當前第4頁；編輯于星期三\16點15分與傳統(tǒng)PCR一樣,反應在溫度模塊里循環(huán)進行:>雙鏈DNA模板變性>引物與模板退火>引物延伸

新的擴增片段定量PCR是如何工作的?理論上每經(jīng)過一個循環(huán)目的基因的數(shù)量都會增加一倍本文檔共108頁；當前第5頁；編輯于星期三\16點15分在PCR混合液中含有熒光物質(zhì)。定量PCR是如何工作的?本文檔共108頁；當前第6頁；編輯于星期三\16點15分無論哪個型號，所有的熒光定量PCR儀都有三個共同的組成部分定量PCR是如何工作的?本文檔共108頁；當前第7頁；編輯于星期三\16點15分PCRPCRLotsofPCRPCRproduct隨著擴增的進行,熒光信號會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加定量PCR是如何工作的?本文檔共108頁；當前第8頁；編輯于星期三\16點15分Real-timePCR儀會記錄每個循環(huán)經(jīng)過每個濾光片的熒光信號變化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:本文檔共108頁；當前第9頁；編輯于星期三\16點15分為什么要用定量PCR？

重復性好

靈敏度高

動力學范圍寬一個好的定量PCR數(shù)據(jù)本文檔共108頁；當前第10頁；編輯于星期三\16點15分1:重復性好本文檔共108頁；當前第11頁；編輯于星期三\16點15分2:靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因本文檔共108頁；當前第12頁；編輯于星期三\16點15分3:動態(tài)范圍寬兼具重復性和準確性的起始模版濃度范圍(越大越好)本文檔共108頁；當前第13頁；編輯于星期三\16點15分為什么要用定量PCR？

快：節(jié)省時間和勞力（不用電泳檢測）。本文檔共108頁；當前第14頁；編輯于星期三\16點15分為什么要用定量PCR？

安全：不用EB或放射性物質(zhì)本文檔共108頁；當前第15頁；編輯于星期三\16點15分定量PCR的化學原理本文檔共108頁；當前第16頁；編輯于星期三\16點15分支持的化學試劑SYBR?GreenITaqMan?本文檔共108頁；當前第17頁；編輯于星期三\16點15分TaqMan?

中會使用到兩段短片段序列，稱為雙向特異引物TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第18頁；編輯于星期三\16點15分第三段短片段序列，又稱為探針,位于序列中間TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第19頁；編輯于星期三\16點15分報告染料Reporterdye淬滅染料Quencherdye探針標記兩種

染料分子TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第20頁；編輯于星期三\16點15分Reporter沒有熒光信號（發(fā)射）能量光(激發(fā))完整的探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第21頁；編輯于星期三\16點15分光能然而，如果探針斷裂了……TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第22頁；編輯于星期三\16點15分Denaturation變性(95oC)TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第23頁；編輯于星期三\16點15分Annealing退火(60oC)TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第24頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶登場……TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第25頁；編輯于星期三\16點15分找到引物序列……TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第26頁；編輯于星期三\16點15分開始延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第27頁；編輯于星期三\16點15分Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第28頁；編輯于星期三\16點15分Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第29頁；編輯于星期三\16點15分?Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第30頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶很特別……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’結合到模板上的DNA片段TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第31頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第32頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第33頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第34頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第35頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第36頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第37頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第38頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第39頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第40頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共108頁；當前第41頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共108頁；當前第42頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共108頁；當前第43頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第44頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第45頁；編輯于星期三\16點15分Taq酶降解探針TaqMan?

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本文檔共108頁；當前第46頁；編輯于星期三\16點15分TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第47頁；編輯于星期三\16點15分TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第48頁；編輯于星期三\16點15分TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第49頁；編輯于星期三\16點15分TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第50頁；編輯于星期三\16點15分嗝!TaqMan?

化學原理

本文檔共108頁；當前第51頁；編輯于星期三\16點15分SYBR?GreenI化學原理本文檔共108頁；當前第52頁；編輯于星期三\16點15分SYBR?GreenI染料本文檔共108頁；當前第53頁；編輯于星期三\16點15分SYBR?GreenI染料本文檔共108頁；當前第54頁；編輯于星期三\16點15分SYBR?GreenI染料本文檔共108頁；當前第55頁；編輯于星期三\16點15分SYBR?GreenI染料的缺點非特異結合任意

雙鏈DNA定量結果不準確非特異性PCR產(chǎn)物信號本文檔共108頁；當前第56頁；編輯于星期三\16點15分使用熔解曲線Meltcurve(DissociationCurve)檢查反應特異性TemperatureFluorescence本文檔共108頁；當前第57頁；編輯于星期三\16點15分Meltcurve:

導數(shù)圖譜一個干凈的峰=沒有無關的產(chǎn)物TemperatureFluorescence本文檔共108頁；當前第58頁；編輯于星期三\16點15分Meltcurve的雜峰可能是引物二聚體本文檔共108頁；當前第59頁；編輯于星期三\16點15分多余的峰是如何產(chǎn)生的?非特異擴增1、轉(zhuǎn)錄組中錯誤的目的基因。2、引物結合在正確的序列,但是既檢測基因組DNA又檢測cDNA(由于短的內(nèi)含子,基因組DNA有較高的Tm值)。解決方法：設計引物時至少有一條跨過外顯子的結合點

引物二聚體本文檔共108頁；當前第60頁；編輯于星期三\16點15分到底用哪一種化學方法呢？TaqMan?,還是SYBR?Green?...本文檔共108頁；當前第61頁；編輯于星期三\16點15分TaqMan?,還是...

SYBR?GreenI?優(yōu)點更高的特異性

不會有引物二聚體干擾支持多重熒光實驗設計實驗方法易于優(yōu)化缺點價格稍貴優(yōu)點價格便宜大部分基因以及少量樣品均適用缺點特異性稍差必須要做Meltcurves不支持多重熒光設計實驗方法通常需要優(yōu)化本文檔共108頁；當前第62頁；編輯于星期三\16點15分定量PCR的數(shù)學原理本文檔共108頁；當前第63頁；編輯于星期三\16點15分怎樣獲得結果首先讓我們定義擴增曲線的各種參數(shù)。本文檔共108頁；當前第64頁；編輯于星期三\16點15分PCR的動力學曲線和四個階段本文檔共108頁；當前第65頁；編輯于星期三\16點15分指數(shù)擴增期重復性準確性動態(tài)范圍3個階段中最佳時期本文檔共108頁；當前第66頁；編輯于星期三\16點15分只有一個擴增期提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)指數(shù)擴增期本文檔共108頁；當前第67頁；編輯于星期三\16點15分基線基線（空白）信號的產(chǎn)生是由于背景引起的本文檔共108頁；當前第68頁；編輯于星期三\16點15分閾值默認閾值=基線（背景）信號標準偏差x10本文檔共108頁；當前第69頁；編輯于星期三\16點15分怎么獲得結果第一步：確定Ct值本文檔共108頁；當前第70頁；編輯于星期三\16點15分怎么獲得結果第二步：比較Ct值本文檔共108頁；當前第71頁；編輯于星期三\16點15分定量PCR的應用絕對定量相對定量陰陽性鑒定基因分型本文檔共108頁；當前第72頁；編輯于星期三\16點15分定量PCR實驗設計和流程

---絕對定量和相對定量本文檔共108頁；當前第73頁；編輯于星期三\16點15分定量PCR的實驗要素

目的基因樣品標準曲線標準品監(jiān)控系統(tǒng)故障陽性對照監(jiān)控污染陰性對照校準生物學誤差內(nèi)參(管家基因)校準物理誤差參比熒光降低隨機誤差重復實驗本文檔共108頁；當前第74頁；編輯于星期三\16點15分相對定量實驗示例實驗未處理樣本處理后樣本目的基因：Plat1實驗目的：樣本處理后，Plat1基因的表達量有什么變化？本文檔共108頁；當前第75頁；編輯于星期三\16點15分實驗流程對照樣本本文檔共108頁；當前第76頁；編輯于星期三\16點15分兩種相對定量的方法比較Ct（ΔΔCt）法相對標準曲線法樣本間目的基因的倍數(shù)關系本文檔共108頁；當前第77頁；編輯于星期三\16點15分兩種方法的區(qū)別

比較Ct(ΔΔCt)法

相對標準曲線法*已知各個基因的擴增效率*每個基因都要做一條標準曲線*不需要每次都做標準曲線*準確的擴增效率計算*簡單,經(jīng)濟,通量較高*工作量大,成本高,通量較低本文檔共108頁；當前第78頁；編輯于星期三\16點15分如何選擇相對定量的方法本文檔共108頁；當前第79頁；編輯于星期三\16點15分如何選擇相對定量的方法本文檔共108頁；當前第80頁；編輯于星期三\16點15分如何選擇相對定量的方法在EXCEL中制作圖表本文檔共108頁；當前第81頁；編輯于星期三\16點15分如何選擇相對定量的方法在EXCEL中制作圖表斜率<0.1斜率>0.1比較Ct(ΔΔCt)法相對標準曲線法本文檔共108頁；當前第82頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法必要條件：目的基因和內(nèi)參基因必須有相一致的擴增效率，并盡可能接近100%。本文檔共108頁；當前第83頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法如何確認擴增效率接近100%？每條引物一條標準曲線本文檔共108頁；當前第84頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法標準曲線可以幫助判定擴增效率例如：斜率-3.3說明擴增效率接近100%；更小的負值（如-3.5）說明擴增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1本文檔共108頁；當前第85頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法結果計算步驟一：內(nèi)參基因均一化樣本差異Ct目的基因-Ct目的基因=

ΔCt步驟二：處理樣本和對照樣本作比較

ΔCt處理樣本-ΔCt對照樣本=

ΔΔCt步驟三：使用公式計算

倍數(shù)變化

=2

-ΔΔCt本文檔共108頁；當前第86頁；編輯于星期三\16點15分公式含義2

-ΔΔCt2=循環(huán)間擴增產(chǎn)物量的變化（PCR擴增產(chǎn)物倍增）ΔΔCt=處理樣本和對照樣本之間校正過大循環(huán)數(shù)的變化所以，這個公式告訴我們對照樣本和處理樣本之間目的基因的倍數(shù)變化。本文檔共108頁；當前第87頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法計算示例本文檔共108頁；當前第88頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法計算示例為了去除樣本間加樣量不同帶來的誤差，需要對數(shù)據(jù)均一化處理。本文檔共108頁；當前第89頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法計算示例首先，選擇對照樣本；接著，均一化對照樣本；然后，所有樣本和對照樣本進行比較。本文檔共108頁；當前第90頁；編輯于星期三\16點15分ΔΔCt法計算示例最后，計算出倍數(shù)關系2

–ΔΔCt。本文檔共108頁；當前第91頁；編輯于星期三\16點15分相對標準曲線法每對引物做一條相對標準曲線本文檔共108頁；當前第92頁；編輯于星期三\16點15分相對標準曲線法計算示例表示倍數(shù)差異本文檔共108頁；當前第93頁；編輯于星期三\16點15分絕對定量實驗

目的：生成標準曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關系；

要求：

濃度已知

標準品與待測樣品的PCR效率一致，且接近100%

–儀器質(zhì)量一致

–試劑質(zhì)量一致：模板純度、引物和探針的Tm值、酶活性、緩

沖液成分

–反應條件一致：循環(huán)參數(shù)相同、同一次實驗標準品的準備本文檔共108頁；當前第94頁；編輯于星期三\16點15分絕對定量實驗Don’t:?制備3個點的2倍標準曲線要求：Do:?制備至少5個點的標準曲線(4logs)?去除離散的重復孔，或者有必要時去除整個梯度數(shù)據(jù)如何制備標準曲線本文檔共108頁；當前第95頁；編輯于星期三\16點15分絕對定量實驗

選擇目標→提取/PCR→純化→測定濃度→調(diào)整濃度→梯度稀釋Ct值在17-30之間，覆蓋全部樣品濃度區(qū)間10倍連續(xù)梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v注：不可由標準品i分別加不同體積的稀釋緩沖液直接得到標準品ii、iii、iv、v標準品梯度稀釋方法本文檔共108頁；當前第96頁；編輯于星期三\16點15分絕對定量實驗擴增效率：每個循環(huán)中靶分子被作為模板利用的百分比。PCR效率的測定本文檔共108頁；當前第97頁；編輯于星期三\16點15分常見問題分析本文檔共108頁；當前第98頁；編輯于星期三\16點15分1.擴增效率為什么達不到100%主要原因：樣品不純擴增產(chǎn)物太長沒有選擇合適的引物退火溫度引物的設計有錯配模板的序列特殊（比如GC含量高）抑制物的存在本文檔共108頁；當前第99頁；編輯于星期三\16點15分2.擴增效率為什么會大于100%主要原因：背景污染非特異性擴增本文檔共108頁；當前第100頁；編輯于星期三\16點15分3.實驗結果的重復性不好對每個樣品我們都要做重復實驗（通常至少為3個重復）目標是所有復孔CT值都相近(通常SD值小于0