基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性

（優(yōu)選）基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性本文檔共100頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20231提綱單核苷酸多態(tài)性 SingleNucleotidePolymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性 GenePolymorphismandGeneticSusceptibilitytoDisease基因多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 GenePolymorphismandRegulationofGeneTranscription展望 FutureProspects本文檔共100頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20232DNAStructure本文檔共100頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20233基因突變基因突變（mutation)：由于DNA堿基對的置換、插入或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化，亦稱點(diǎn)突變。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式，基因突變可分為堿基置換突變和移碼突變兩種類型：堿基置換突變：由一個錯誤的堿基對替代一個正確的堿基對的突變叫堿基置換突變。堿基替換過程只改變被替換堿基的那個密碼子，也就是說每一次堿基替換只改變一個密碼子，不會涉及到其他的密碼子。移碼突變：基因中插入或者缺失一個或幾個堿基對，使DNA的閱讀框架（讀碼框）發(fā)生改變，導(dǎo)致插入或缺失部位之后的所有密碼子都跟著發(fā)生變化，結(jié)果產(chǎn)生一種異常的多肽鏈。本文檔共100頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20234基因突變根據(jù)遺傳信息的改變方式，基因突變又可以分為同義突變、錯義突變和無義突變?nèi)N類型：同義突變：DNA的一個堿基對的改變并不會影響它所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這是因?yàn)楦淖兒蟮拿艽a子和改變前的密碼子是簡并密碼子，它們編碼同一種氨基酸，這種基因突變稱為同義突變。錯義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯義突變。這種基因突變有可能使它所編碼的蛋白質(zhì)部分或完全失活。無義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子的基因突變叫無義突變。本文檔共100頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20235單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNPs）：是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個堿基對中就有1個，人類30億堿基中大約有1000萬個SNPs。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性可以只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition，嘌呤>嘌呤或嘧啶>嘧啶)或顛換(transversion，嘌呤<—>嘧啶)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。本文檔共100頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20236單核苷酸多態(tài)性理論上，SNPs可以分二、三和四等位基因，但人類一般為二等位基因（biallelic）。二等位基因有4種不同類型，包括1種轉(zhuǎn)換C>T(G>A)和3種顛換C>A(G>T)、C>G(G>C)、T>A(A>T)。四種SNPs類型在人類中的發(fā)生頻率不同，最常見的為C>T(G>A)轉(zhuǎn)換，約占2/3，其它3種類型發(fā)生的頻率相同。之所以轉(zhuǎn)換幾率高，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。本文檔共100頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20237單核苷酸多態(tài)性ExampleofanSNPcomprisingaG>AsubstitutionElectropherogramsproducedbyfluorescence-basedsequencingusinganABI3700showingthegenomicDNAfromanindividualhomozygousforGatthesiteoftheSNP(a)andanindividualhomozygousforA(b).Thebasesubstitutionisdenotedbyanarrow.本文檔共100頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20238單核苷酸多態(tài)性人類基因組中大約估計每個基因有2個常見的錯義突變在公共數(shù)據(jù)庫中至少有500萬個SNPs。僅有少量（可能為50,000–250,000）SNPs在一定程度上（小到中等度）能反映與疾病發(fā)生危險相關(guān)的表型。根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-regionSNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（PerigenicSNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（IntergenicSNPs，iSNPs）等三類。SNPs在基因組中的分布十分廣泛，但不同的區(qū)域出現(xiàn)的頻率不同。人類單堿基等位基因十分穩(wěn)定。人類SNPs大部分(85%)是共有的。本文檔共100頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/20239單核苷酸多態(tài)性63%Intronic（內(nèi)含子）

24%Locusregion（基因座區(qū)）11%Untranslatedregion（非翻譯區(qū)）1%Nonsynonymous（nsSNPs，錯義SNPs）1%Synonymous（同義SNPs）<1%Splicesite（剪接位點(diǎn)）<1%Unknowncodingvariant（不明編碼變異）SNPs分布區(qū)域：本文檔共100頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202310單核苷酸多態(tài)性SNPs應(yīng)用多基因病和復(fù)雜性疾病如人類腫瘤、糖尿病、自身免疫性疾病、老年性癡呆等的遺傳連鎖分析(linkageanalysis)及關(guān)聯(lián)分析(associationanalysis)，用于疾病易感基因定位和克隆。“藥物基因組學(xué)”(pharmacogenomics)研究中用于揭示人群中不同個體對不同藥物的敏感性差異的根本原因。法醫(yī)研究的罪犯身份的鑒別、親子鑒定等。在器官移植中供體和受體間的配對選擇。研究人類起源、進(jìn)化和群體遺傳學(xué)特征。人類基因組SNPs研究所揭示的人種、人群和個體之間DNA序列的差異以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對疾病的診斷、治療和預(yù)防帶來革命性的變化。

本文檔共100頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202311單核苷酸多態(tài)性今后SNP的研究主要包括兩個方面：SNP數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：主要目的是發(fā)現(xiàn)特定種類生物基因組的全部或部分SNP。大規(guī)模SNP數(shù)據(jù)庫構(gòu)建只是基因組序列分析中心可以勝任的工作,常規(guī)實(shí)驗(yàn)室是不太可能進(jìn)行該工作的。SNP功能的研究：發(fā)現(xiàn)SNP只是SNP研究的第一步，而SNP功能的研究才是SNP研究的目的。特定DNA區(qū)域的特定SNP在特定群體的序列驗(yàn)證和頻率分析以及SNP與特定生理/病理狀態(tài)關(guān)系的研究是SNP研究的主要方面。本文檔共100頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202312提綱單核苷酸多態(tài)性 SingleNucleotidePolymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性 GenePolymorphismandGeneticSusceptibilitytoDisease基因多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 GenePolymorphismandRegulationofGeneTranscription展望 FutureProspects本文檔共100頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202313問題基因選擇哪些基因和位點(diǎn)值得研究？相對于全基因組，候選基因研究有何優(yōu)點(diǎn)？如何將SNP功能信息融入相關(guān)性研究中？實(shí)驗(yàn)室方面如何選擇合適的實(shí)驗(yàn)室方法？如何進(jìn)行質(zhì)量控制？如何利用公共數(shù)據(jù)庫信息？研究設(shè)計和數(shù)據(jù)分析何種研究設(shè)計和分析方法是實(shí)現(xiàn)研究重現(xiàn)性所必需？如何處理人群遺傳結(jié)構(gòu)上的差異，如單倍體區(qū)段、種族差異等？本文檔共100頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202314基因選擇各物種基因數(shù)量比較物種 基因數(shù)量小鼠（Mouse） 30,000擬南芥（Arabidopsis） 27,000人類（Human） 25,000線蟲（C.elegans） 19,500本文檔共100頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202315基因選擇候選基因（CandidateGenes）候選基因具有對生物學(xué)合理性(biologicalplausibility)和疾病因果關(guān)系(diseasecausality)作最大化推理(maximizinginferences)的優(yōu)點(diǎn)。候選基因可根據(jù)某一特定疾病發(fā)生過程中基因功能信息來加以限制。本文檔共100頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202316基因選擇生物學(xué)上的考慮：基于疾病的發(fā)病機(jī)制(生物學(xué)合理性、權(quán)威的科學(xué)假說等)易感基因（susceptivegenes）敏感基因（sensitivegenes）生物學(xué)通路（biologicalpathways）本文檔共100頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202317ApoptosisPathway本文檔共100頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202318BaseExcisionRepairPathway本文檔共100頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202319NucleotideExcisionRepair本文檔共100頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202320DoubleStrandBreakRepairPathway本文檔共100頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202321TranscriptionCoupledRepairPathway本文檔共100頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202322CystathionineMTHFRTS/TYMSMTHFR=methylenetetrahydrofolatereductaseTS/TYMS=thymidylatesynthaseFS=10-formylTHFsynthaseSHMT=serinehydroxymethyltransferaseMTHFD=5,10-methylenetetrahydrofolatedehydrogenaseMS/MTR=methioninesynthaseMTRR=methioninesynthasereductaseBHMT

=batainehydroxymethyltransferaseDHFR=dihydrofolatereductaseCBS=cystathionine-synthaseCBSMS/MTRDHFRMTRRSHMTBHMTFSMTHFDFolateMetabolismPathway本文檔共100頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202323

DNADamage-ResponsePathwayp53ProteinAccumulation

DNADAMAGEBindingtoTranscription-Replication-RepairFactorsTFIIH(XPB,XPD)andp62bindstop53PCNA(p21WAF1andGADD45)AlteredExpressionBAXandFasBcl2IncreasedExpressionp21WAF1,MDM2,cyclinG,andGADD45CellCycleArrestDNARepairCancerApoptosisTranscriptionDependentApoptosisTranscriptionIndependentApoptosisModifiedfromHarris,1994本文檔共100頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202324基因選擇藥物治療反應(yīng)（treatmentresponse）基因表達(dá)改變（geneexpressionchanges）病人的存活狀況（survivalstatus）藥物的毒副反應(yīng)（sideeffectsortoxicities）這些因素與某一特定藥物、后續(xù)事件的時序以及劑量等有關(guān)。如在藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)研究領(lǐng)域，在選擇候選基因時可考慮下列因素：本文檔共100頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202325多態(tài)性位點(diǎn)選擇復(fù)雜疾病的易感性往往是由稀少的變異（rarevariants）所決定。牛津大學(xué)統(tǒng)計學(xué)系的Pritchard在美國人類遺傳學(xué)雜志上發(fā)表了“Arerarevariantsresponsibleforsusceptibilitytocomplexdiseases?”綜述闡述了這一觀點(diǎn)。nsSNPs或調(diào)控SNPs（rSNPs，指可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控改變的SNPs）是人類個體間差異的重要分子基礎(chǔ)。未來研究的重要挑戰(zhàn)是對rSNPs的識別和功能揭示。本文檔共100頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202326多態(tài)性位點(diǎn)選擇選擇次序編碼區(qū)SNPs：外顯子(exon)非編碼區(qū)SNPs啟動子區(qū)(promoterregion)5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)剪接位點(diǎn)(splicesite)3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)內(nèi)含子(intron)本文檔共100頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202327多態(tài)性位點(diǎn)選擇全基因組和基于單倍體型的研究合適的流行病學(xué)設(shè)計和足夠的統(tǒng)計學(xué)功效（statisticalpower）是必需的。盡管全基因組研究不易重復(fù)，但仍可識別基因組中與疾病發(fā)生存在因果關(guān)系的區(qū)域（causativeregions）。連鎖不平衡區(qū)段（linkagedisequilibriumblocks)存在于整個基因組中，但其長度可因人群遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異而不同。采用單倍體區(qū)段（haplotypeblock）的信息較單純基于SNP的分析可提高15–50%的功效。本文檔共100頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202328總結(jié)全基因組研究方法在今后的研究中是可行的，但在高通量、數(shù)據(jù)庫以及統(tǒng)計分析方面將面臨巨大挑戰(zhàn)。候選基因方法在確定特定疾病因果關(guān)系上仍然具有重要的意義。單核苷酸多態(tài)性的功能學(xué)意義是理解和認(rèn)識流行病學(xué)相關(guān)性研究生物學(xué)基礎(chǔ)的關(guān)鍵。在相關(guān)性研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)該深入探討SNPs的功能，包括對基因翻譯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等的作用。本文檔共100頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202329實(shí)驗(yàn)室研究高并聯(lián)（highparallel）：小樣本多位點(diǎn)高通量（highthroughput）：大樣本少位點(diǎn)理想的基因分型方法應(yīng)包括5-10%重復(fù)樣本優(yōu)化實(shí)驗(yàn)通量和質(zhì)量控制，兩種方案：本文檔共100頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202330實(shí)驗(yàn)室研究實(shí)驗(yàn)室研究的主要問題是質(zhì)量控制基因型的錯誤分類(misclassification)可導(dǎo)致偏倚(bias)常見的實(shí)驗(yàn)室問題包括DNA污染、DNA質(zhì)量或數(shù)量不合適、樣本/板方向標(biāo)錯、檢測誤差等?；蚍中蜁r應(yīng)包括盲樣重復(fù)、陽性對照和空白對照。對于病例—對照研究，病例和對照樣本不應(yīng)分開檢測以減少潛在的錯誤。本文檔共100頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202331實(shí)驗(yàn)室研究基因多態(tài)性的檢測方法

PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）：限制性片段長度多態(tài)性PCR-SSCP（singlestrandconformationpolymorphism）：單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析PCR-SSP（SequenceSpecificPrimers）：序列特異引物聚合酶鏈反應(yīng)DNASequencing：DNA測序PCR-ASO（allelespecificoligonucleotide）：等位基因特異性寡核苷酸探針法PCR-SSO（sequencespecificoligonucleotide）：順序特異寡核苷酸法PCR-熒光法PCR-fingerprints：PCR指紋圖法DNAMicroarray：DNA微探針陣列，又稱基因芯片法AFLP（amplicationfragmentlengthpolymorphism）：擴(kuò)增基因組DNA限制性片段法DGGE（denaturinggradinentelectrophoresis）：變性梯度凝膠電泳法RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）：隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA法

本文檔共100頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202332基因組數(shù)據(jù)庫資源公共數(shù)據(jù)庫和資源，常用的網(wǎng)址如下：http:///SNP(NationalCenterforBiotechnologyInformation)http:///(NIEHSSNPsProgram)/home_1.cfm?CFID=264728&CFTOKEN=86045010(SNP500Cancer)http://(Pubmed)(SNPsdatabasefromJapan)http:///nomenclature/(HUGOGeneNomenclatureCommittee)http://(Blastsearch)……本文檔共100頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202333基因組數(shù)據(jù)庫資源存在的問題數(shù)據(jù)庫中存在許多錯誤：所報告的編碼區(qū)5-16%的SNPs因復(fù)制片段(復(fù)制子,duplicon)而成為共生同源變異(paralogousvariants),因此并非真正的SNPs。有15–30%的SNPs沒有經(jīng)過驗(yàn)證（verified），因此可能是不存在的。數(shù)據(jù)庫往往是基于少量的信息因?yàn)镾NP頻率存在種族差異，因此SNP頻率如果沒有種族類型報告，該數(shù)據(jù)可能是不可用的。本文檔共100頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202334研究設(shè)計和統(tǒng)計分析疾病遺傳易感性的分子流行病學(xué)研究：利用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、分子遺傳學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的技術(shù)和手段，在疾病發(fā)病機(jī)制方面開展的基因多態(tài)性、基因與環(huán)境交互作用等相關(guān)的研究。常見的研究方法包括病例—對照研究、前瞻性隊(duì)列研究、病例—病例研究等。本文檔共100頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202335研究設(shè)計和統(tǒng)計分析以現(xiàn)在確診的患有某特定疾病的病人作為病例，以不患有該病但具有可比性的個體作為對照，通過詢問，實(shí)驗(yàn)室檢查或復(fù)查病史，搜集既往各種可能的危險因素的暴露史，測量并比較病例組與對照組中各因素的暴露比例，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，若兩組差別有意義，則可認(rèn)為因素與疾病之間存在著統(tǒng)計學(xué)上的關(guān)聯(lián)。一種回顧性的，由結(jié)果探索病因的研究方法，是在疾病發(fā)生之后去追溯假定的病因因素的方法。分為病例與對照不匹配（unmatching）和病例與對照匹配(matching)兩種類型。匹配要求對照在某些因素或特征上與病例保持一致，目的是對兩組進(jìn)行比較時排除匹配因素的干擾：分為頻數(shù)匹配(frequency-matching)和個體匹配（1:1,1:2…1:R，一般不超過1:4，否則統(tǒng)計效率下降）。病例—對照研究（Case-ControlStudy)本文檔共100頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202336研究設(shè)計和統(tǒng)計分析病例與對照的基本來源有兩個:一個來源是醫(yī)院的現(xiàn)患病人、醫(yī)院、門診的病案，及出院記錄，稱為以醫(yī)院為基礎(chǔ)的（hospital-based）；另一個來源是社區(qū)、社區(qū)的監(jiān)測資料或普查、抽查的人群資料，稱為以社區(qū)為基礎(chǔ)的（community-based）。病例的選擇主要是確定判斷病人的標(biāo)準(zhǔn)和怎樣獲得這些符合判斷標(biāo)準(zhǔn)的病人；對照最好是全人群的一個無偏樣本，或是產(chǎn)生病例的人群中全體非患該病的人的一個隨機(jī)樣本，而且也經(jīng)過相同診斷確認(rèn)為不患所研究的疾病。病例—對照研究（Case-ControlStudy)本文檔共100頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202337研究設(shè)計和統(tǒng)計分析影響樣本大小的因素:

病例對照研究樣本大小取決于四個參數(shù)

1.研究因素在對照人群中的暴露率(P0)

2.預(yù)期暴露于該研究因素造成的相對危險度(RR)或比值比(OR)

3.希望達(dá)到的檢驗(yàn)性水平，即假設(shè)檢驗(yàn)第I類錯誤，即假設(shè)檢驗(yàn)所允許的假陽性錯誤的概率。

4.希望達(dá)到的檢驗(yàn)把握度(1-)，為假設(shè)檢驗(yàn)第II類錯誤，即假設(shè)檢驗(yàn)所允許的假陰性錯誤的概率。 病例—對照研究（Case-ControlStudy)本文檔共100頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202338研究設(shè)計和統(tǒng)計分析樣本量估計方法：不同配比方式的樣本大小計算方法不同，可用公式計算或從樣本量表中查得。需要注意的是：所估計的樣本含量并非絕對精確的數(shù)值，因?yàn)闃颖竞康墓烙嬍怯袟l件的，而這些條件并非是一成不變的。應(yīng)當(dāng)糾正樣本量越大越好的錯誤看法。樣本量過大，常會影響調(diào)查工作的質(zhì)量，增加負(fù)擔(dān)、費(fèi)用。病例組和對照組樣本含量相等時效率最高。病例—對照研究（Case-ControlStudy)本文檔共100頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202339研究設(shè)計和統(tǒng)計分析如頻率匹配的病例對照研究樣本量估計N=2×A×(1-A)×(Z+Z)2/(p1-p0)2式中:N為病例組和對照組人數(shù),Z、Z分別為及值相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布分位數(shù)，可查表求得，p0和p1分別為對照組和病例組某因素的估計暴露率。

q0=1-p0,

q1=1-p1,A=(p0+p1)/2其中p1也可由計算公式求得:p1=(OR×p0)/(1-p0+OR×p0)，也可簡化成p1=(OR×p0)/[1+p0(OR-1)]。本文檔共100頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202340研究設(shè)計和統(tǒng)計分析

標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)表

或Z(單側(cè)檢驗(yàn))Z(雙側(cè)檢驗(yàn))

Z(單側(cè)和雙側(cè)檢驗(yàn))

0.0013.0903.290

0.0022.8783.090

0.0052.5762.807

0.0102.3262.576

0.0202.0582.326

0.0251.9602.242

0.0501.6451.960

0.1001.2821.645

0.2000.8421.282

本文檔共100頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202341研究設(shè)計和統(tǒng)計分析樣本量大小估計舉例擬進(jìn)行一項(xiàng)病例對照研究，研究吸煙和肺癌的關(guān)系。一般人群吸煙率約為20%，吸煙和肺癌的比值比為2.0，要求=0.05（雙側(cè)），=0.10，估計樣本大小N。

求p1：p1=(2×0.2)/(1-0.2+2×0.2)=0.333

q0=1-0.2=0.8

q1=1-0.333=0.667

A=(0.2+0.333)/2=0.267

查標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)表得Z=1.960,

Z=1.282

N=2×0.267×(1-0.267)×(1.960+1.282)2/(0.333-0.2)2=232即每組需要232人。本文檔共100頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202342CancerCancer-freeCase-ControlStudySusceptibility:Diet,Metabolism,DNAdamage&Repair…Carcinogenes

Oddsratio(OR)toestimate

relativerisk–probabilityofdevelopingcancerOR=1,noriskOR>1,increasedriskOR<1,protectiveeffectQuestionnairedataBiomarkerassays本文檔共100頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202343研究設(shè)計和統(tǒng)計分析以基于醫(yī)院的腫瘤病例—對照研究為例病例：病人應(yīng)為新診斷、病理學(xué)確診；未經(jīng)放療或化療；無腫瘤病史；無輸血史…對照：無腫瘤者，可從醫(yī)療或保健機(jī)構(gòu)中招募的，與病例無生物學(xué)上相關(guān)的醫(yī)療求助者或病人陪伴著。病例應(yīng)與對照在年齡、性別、種族和吸煙狀況上在頻率上相匹配或采用個體匹配。正式的知情同意書、流行病學(xué)調(diào)查表和血液采集。統(tǒng)計分析：采用t檢驗(yàn)、方差檢驗(yàn)和多因素logistic回歸分析等。本文檔共100頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202344研究設(shè)計和統(tǒng)計分析選定暴露于及未暴露于某因素的兩組人群，隨訪觀察一定的期間，比較兩組人群某種疾病的結(jié)局，從而判斷該因素與發(fā)病或死亡有無關(guān)聯(lián)及關(guān)聯(lián)大小的研究方法。特點(diǎn)屬于觀察法，需設(shè)立對照組。由“因”及“果”，時序合理，檢驗(yàn)暴露因素與疾病的因果聯(lián)系科學(xué)性強(qiáng)。最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲取相對真實(shí)而可靠的資料。但是如果需要觀察大量人群，則花費(fèi)太大。如果疾病的潛伏期很長，則需要觀察的時間很長。這些都會影響其可行性。用途檢驗(yàn)病因假設(shè)：驗(yàn)證某種暴露因素對某種疾病發(fā)病率或死亡率的影響，也可同時觀察某種暴露因素對人群健康的系統(tǒng)影響。描述疾病的自然史：疾病的自然發(fā)展過程，包括疾病的起病（病理發(fā)生期）、潛伏期(隱伏期)、臨床前期、臨床期到結(jié)局的全過程。前瞻性隊(duì)列（或群組）研究（CohortStudy)本文檔共100頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202345Susceptibility:Diet,Metabolism,DNAdamage&Repair…Carcinogenes

CancerCancer-freeGeneticpredisposition?(遺傳易患體質(zhì)？)Biomarkersforpreventionandearlydetection?CohortStudy本文檔共100頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202346研究設(shè)計和統(tǒng)計分析又稱為單純病例研究（caseonlystudy）或病例系列研究（caseseriesstudy）。病例-病例研究是近年來被廣泛應(yīng)用于疾病病因研究中評價基因與環(huán)境交互作用的一種方法，該方法僅通過某一疾病患者群體來評價基因型與環(huán)境暴露的交互作用，但不能評價二者各自的主效應(yīng)。有時在一般病例對照研究中不易選擇合適的對照，特別是在分子流行病學(xué)研究中，從無疾病的對照中去獲取某種生物標(biāo)本也受到醫(yī)學(xué)倫理方面的制約。如果對一種疾病的兩個亞型進(jìn)行對比研究，例如出血型腦卒中與缺血型腦卒中、p53突變陽性基因型的食管癌與p53突變陰性基因型的食管癌或者食管癌的鱗癌與腺癌的比較研究，可以不另外設(shè)對照組，而采取兩個亞組的直接比較。這種設(shè)計可以免除從無病的對照組收集資料特別是生物標(biāo)本的麻煩，適用于研究兩組病因的差異部分，而其相同或近似的危險因素則將被掩蓋或低估。病例-病例研究（Case-CaseStudy）本文檔共100頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202347研究設(shè)計和統(tǒng)計分析應(yīng)用的前提條件：在正常人群中基因型與環(huán)境暴露各自獨(dú)立發(fā)生，而且所研究的疾病為罕見病(此時可用OR來估計RR值)?；静襟E：確定某一患者群體作為研究對象收集病人的一般情況、協(xié)變量、環(huán)境暴露資料，以及生物標(biāo)本。采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因型根據(jù)某一基因型的有無將研究對象分為類病例組和類對照組統(tǒng)計分析，計算OR值、P值。判斷有無相乘模型的交互作用及顯著性意義。若有，進(jìn)一步判斷為正相乘作用還是負(fù)相乘作用。病例-病例研究（Case-CaseStudy）本文檔共100頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202348BloodSampleProcessingandBiomarkerAssayFlowChartPHAPHASpinWholebloodshort-termculture1ml1ml1mlMutagensensitivityassayBPDE

ControlBPDEGamma1mlBPDE-InduceDNAadductsassayDNAextraction1mlRT-PCRforgeneexpressionLong-termstoragecDNADNA1mlRNAextractionGenotypingLymphocyteisolation(frozen)CAT/LucassaysDNArepaircapacity2mleachTransfectionHeparinized,10-30mlSamplecollection(casesandcontrols)1mlPlasmaSerum本文檔共100頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202349研究設(shè)計和統(tǒng)計分析相關(guān)性研究結(jié)果可重復(fù)嗎？

遺憾的是，大多數(shù)結(jié)果不能重復(fù)。假陽性報告（false-positivereports)：偽相關(guān)（spuriousassociations)假陰性報告（false-negativereports）：該研究無足夠的效能來識別該相關(guān)性人群之間存在的差異（populationdifferences）本文檔共100頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202350研究設(shè)計和統(tǒng)計分析在相關(guān)性研究結(jié)果缺乏一致性時，應(yīng)采用何種可信度水平？大樣本(largesamplesize)避免出版偏差(avoidpublicationbias)種族分層(ethnicstratification) …本文檔共100頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202351研究設(shè)計和統(tǒng)計分析影響相關(guān)性研究結(jié)果的因素：病因?qū)W上的復(fù)雜性(etiologicalcomplexity)統(tǒng)計效能和采樣設(shè)計(statisticalpowerandsamplingdesign)人群結(jié)構(gòu)(populationstructure)數(shù)據(jù)解釋(datainterpretation)本文檔共100頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202352研究設(shè)計和統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)解釋（DataInterpretation）

有幾種情況：顯著關(guān)聯(lián)、無重要關(guān)聯(lián)、無法決定。假陽性報告概率（falsepositivereportprobability，F(xiàn)PRP）有助于作出判斷FPRP取決于先驗(yàn)概率（priorprobability）、統(tǒng)計效能（statisticalpower）和效能指數(shù)（effectsize）。統(tǒng)計效能：指當(dāng)H0為錯時你正確地拒絕H0的概率（significanceoftherelationshipundertest）效能指數(shù)：是指被檢驗(yàn)的兩變量之間關(guān)系的強(qiáng)度(strengthoftherelationshipundertest）。兩者均與樣本大小有關(guān)。本文檔共100頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202353研究設(shè)計和統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)解釋（DataInterpretation）當(dāng)先驗(yàn)概率較高時，那么假陽性報告概率將較低，其關(guān)聯(lián)性將更趨正確。研究者必須選擇一個臨床或病因?qū)W上有意義的效能指數(shù)，如相對危險度（relativerisk，RR）或比值比（oddsratio,OR）以及先驗(yàn)范圍。通常我們計算并比較OR值及其95%可信限（95%confidenceinterval,95%CI）。本文檔共100頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202354提綱單核苷酸多態(tài)性 SingleNucleotidePolymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性 GenePolymorphismandGeneticSusceptibilitytoDisease基因多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 GenePolymorphismandRegulationofGeneTranscription展望 FutureProspects本文檔共100頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202355啟動子與基因轉(zhuǎn)錄本文檔共100頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202356PromoterRegion本文檔共100頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202357ControlsitesinDNAprovidebindingsitesforproteins;codingregionsareexpressedviathesynthesisofRNA本文檔共100頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202358基本概念啟動子(promoter):位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游的一段DNA序列指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合活化RNA聚合酶啟動基因轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)(promoterregion):RNA聚合酶(RNApolymerases)同啟動子結(jié)合的區(qū)域RNA聚合酶:利用DNA模板合成RNA的酶本文檔共100頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202359RNA聚合酶的活性形式(全酶)為15S，由5種不同的多肽鏈構(gòu)成，按分子量大小排列分別為β‘(155000)，β(151000)，σ(7000)，α(36500)和ω(11000)。每分子RNA聚合酶除有兩個α亞基外，其余亞基均只有一個，故全酶為β’βα2σω(450000)。全酶是指酶蛋白及其輔酶構(gòu)成的有功能的復(fù)合物。本文檔共100頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202360ThefunctionofRNApolymeraseistocopyonestrandofduplexDNAintoRNA本文檔共100頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202361基本概念共有序列(consensussequence)是指與真實(shí)序列相比，啟動子每個位置最常出現(xiàn)的理想化堿基序列。即將所有已知啟動子排列起來以求其最大相似性。一個序列如果為共有，則每一個特定堿基都理應(yīng)在相應(yīng)位置上有分布優(yōu)勢。大多數(shù)共有序列間的堿基差異不能超過1-2個。本文檔共100頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202362啟動子結(jié)構(gòu)

有多種元件：TATA框、GC框、CATT框、OCT等。結(jié)構(gòu)不恒定：有的有多種框盒如組蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期轉(zhuǎn)錄蛋白。它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同。有的存在遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件，如增強(qiáng)子。這些元件常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作用。不直接和RNA聚合酶結(jié)合。轉(zhuǎn)錄時先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合，再和聚合酶結(jié)合。真核生物中有三種不同的RNA聚合酶，因此也有三種不同的啟動子，其中以啟動子Ⅱ最為復(fù)雜，它和原核的啟動子有很多不同：本文檔共100頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202363RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，只有帶σ因子的全酶才能專一地同啟動子結(jié)合。RNA聚合酶沿著模板前進(jìn)，直到終止子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條RNA鏈。通常把基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)前面即5’端的序列稱為上游(upstream)，起點(diǎn)后面即3’端的序列稱為下游(downstream)。并把起點(diǎn)的位置記為+1，下游的核苷酸依次記為+2，+3，……，上游方向依次記為-1，-2，-3，……啟動子結(jié)構(gòu)

本文檔共100頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202364啟動子結(jié)構(gòu)在真核基因中，有少數(shù)基因沒有TATA框。沒有TATA框的真核基因啟動子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的則沒有GC框。GC框位于-80~-110bp處的GCCACACCC或GGGCGGG序列。TATA框的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始；CAAT框和GC框則主要是控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，特別是CAAT框?qū)D(zhuǎn)錄起始頻率的作用更大。在真核生物中，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游70-80bp處有CAAT順序，也稱為CAAT盒，是比較保守的共有序列：GCCTCAATCT。本文檔共100頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202365DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合

研究策略本文檔共100頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202366背景基因轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。在基因表達(dá)的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是關(guān)鍵。常常某個基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)決定于在特定的啟動子起始過程。啟動子區(qū)DNA結(jié)合蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過與啟動子DNA結(jié)合以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。猶如抗原-抗體特異性結(jié)合一樣，蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合也是特異的，這是研究啟動子區(qū)DNA結(jié)合蛋白的前提。本文檔共100頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202367DNA-bindingandactivatingfunctionsinatranscriptionfactormaycompriseindependentdomainsoftheprotein本文檔共100頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202368研究方案細(xì)胞內(nèi)法(invivo):以已知啟動子DNA序列篩選出與其相結(jié)合的蛋白編碼基因,通過生物信息分析來確定該蛋白質(zhì)的名稱。優(yōu)點(diǎn)：更符合生理狀態(tài)，操作簡便，適合大通量篩選，用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：一是只能篩選可與啟動子DNA特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，但不能檢查出精確的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；二是特異性略差。常用的有酵母單雜交(Yeastonehybrid)技術(shù)、噬菌體表面展示(Phagedisplay)技術(shù)等。本文檔共100頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202369研究方案細(xì)胞外法(invitro)：即在體外用重組的已知蛋白質(zhì)與啟動子DNA結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：特異性好，且能夠在啟動子DNA序列上找到精確的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。缺點(diǎn)：效率低，操作復(fù)雜，一般不用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)。常用的有EMSA(electrophoreticmobility-shiftassay)、DNaseIfoot-printingassay等。本文檔共100頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202370凝膠遷移率變動試驗(yàn)(EMSA)基本原理為：在凝膠電泳中，由于電場的作用，小分子DNA片段比其結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽極移動的速度快。若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，則其向陽極移動的速度受到阻滯，在凝膠放射性自顯影上或生物素標(biāo)記，就可找到DNA結(jié)合蛋白。本文檔共100頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202371超級EMSA超級EMSA，即Super-shiftassay,是EMSA試驗(yàn)的改進(jìn)，將DNA與更多的蛋白結(jié)合，這樣，與特異性蛋白結(jié)合的目的DNA移動速度進(jìn)一步減慢。由于凝膠遷移率變動試驗(yàn)的特異性好，常用來鑒定其它方法篩選出的結(jié)果。顯而易見，克隆啟動子DNA片段并標(biāo)記，用該實(shí)驗(yàn)就可找到相應(yīng)的結(jié)合蛋白。本文檔共100頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202372EMSA優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、敏感缺點(diǎn):需已知目標(biāo)DNA序列DNA序列較短,一般為20-30個核苷酸。體外（非體內(nèi)）檢測方法本文檔共100頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202373EMSA原理(a)ThebindingsiteofinterestissynthesizedasashortradiolabelledDNAprobewhichcanbeusedtoidentifybothknownandnovelfactorsbindingtothecandidateregion.OnceboundtoDNA,aprotein–DNAcomplexisstabilizedwhensubjectedtonon-denaturingPAGE,allowingresolutionofprotein–DNAcomplexesasdiscretebands.(b)Thespecificityoftheinteractionmaybeinvestigatedbycompetitionexperimentsinwhichtypically10-or100-foldexcessunlabelledprobeisadded,which,inthecaseofaspecificcompetitorprobe,resultsinprogressivelylessradiolabelledprobeboundbythetranscriptionfactorprotein.本文檔共100頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202374DNaseI足跡試驗(yàn)足跡試驗(yàn)（foot-printingassay）不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白，而且能告知目標(biāo)蛋白結(jié)合的堿基部位。足跡試驗(yàn)的方法較多，常用的有DNaseI足跡試驗(yàn)、硫酸二甲酯(dimethylsulfate,DMS)足跡試驗(yàn)，二者原理基本相同?；驹恚旱鞍捉Y(jié)合在DNA片段上，保護(hù)結(jié)合部位不被DNaseI破壞，這樣，蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒有放射性標(biāo)記條帶。本文檔共100頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202375PrincipleoftheDNaseIfoot-printingassay(含乳糖操縱子DNA)(乳糖阻遏物)本文檔共100頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202376PrincipleoftheDNaseIfoot-printingassay本文檔共100頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202377DNaseI足跡試驗(yàn)技術(shù)流程：1.標(biāo)記探針：待檢雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，通常只標(biāo)記一端。2.結(jié)合和消化：蛋白質(zhì)與DNA混合，待二者結(jié)合后，加入適量的DNaseI以消化DNA分子，控制酶的用量，使之達(dá)到每個DNA分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，同時設(shè)未加蛋白質(zhì)的對照。3.電泳和顯影：從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA加樣在測序凝膠中作電泳和放射性自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。本文檔共100頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202378啟動子區(qū)SNPs

的功能研究本文檔共100頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202379背景編碼DNA(CodingDNA)：外顯子(exons)

氨基酸改變或轉(zhuǎn)錄mRNA非編碼DNA(Non-codingDNA)：啟動子(promoter)、內(nèi)含子(introns)、5’-非翻譯區(qū)(5’-UTR)、3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)

基因表達(dá)(假定的調(diào)控區(qū)，putativeregulatoryregions)

轉(zhuǎn)錄(啟動子區(qū))本文檔共100頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202380背景如果SNPs發(fā)生在DNA編碼區(qū)，可引起翻譯蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生改變，即使是同義突變(synonymousmutation)，該SNPs的功能效應(yīng)也可在mRNA水平檢出。如果SNPs發(fā)生在非編碼區(qū)，特別是基因上游的啟動子區(qū)，則可能影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。如果SNPs位于某轉(zhuǎn)錄因子的共有序列中，將可能改變該轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的親和性(affinity),或引入一個新的因子與DNA結(jié)合，從而可能改變該基因轉(zhuǎn)錄過程的特異性和動力學(xué)特征。發(fā)生在非編碼區(qū)的SNPs的功能效應(yīng)難以直接檢出，必須通過諸如轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)等手段間接檢測。本文檔共100頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202381轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)基因的啟動子區(qū)域中含有許多重要的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列（順式元件），若要闡明基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制（包括啟動子區(qū)SNPs功能研究），克隆啟動子序列是必不可缺的關(guān)鍵一環(huán)。到目前為止，已闡明啟動子序列以及它們的調(diào)控機(jī)制的基因數(shù)量非常有限。標(biāo)準(zhǔn)的真核生物有關(guān)的啟動子數(shù)據(jù)庫EukaryoticPromoterDatabase中登錄的基因啟動子也不過數(shù)百個，其中一個重要原因之一是許多基因未能確切的確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。本文檔共100頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202382轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)理想的克隆cDNA應(yīng)包含模板mRNA的5‘帽的結(jié)構(gòu)以及3’多聚A尾的全長序列。傳統(tǒng)的方法克隆的cDNA，多數(shù)情況下其5‘末端為部分缺失狀態(tài)。究其原因有二：一是在以mRNA模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶在從模板mRNA中脫落，只能得到部分拷貝的cDNA產(chǎn)物。二是在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中，用了部分5‘末端被降解的mRNA為模板合成cDNA。因此，在構(gòu)建cDNA文庫中得到的多數(shù)是5‘末端部分缺失狀態(tài)的cDNA。換言之，在構(gòu)建cDNA文庫的過程中，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶以及應(yīng)用極易受降解的mRNA是不可避免的，因此5’末端部分缺失就不足為奇了。本文檔共100頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202383轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)S1核酸酶作圖法、引物延伸法(RT)、5‘-RACE(rapidamplificationofcDNAends)法等傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的確定方法，技術(shù)要求比較高，且有時由于種種原因，難以確定確切的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。隨著生物信息學(xué)（Bioinformatics)的發(fā)展，網(wǎng)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫逐漸豐富，這為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的研究提供了一個新的思路。最近，由日本鈴木等開發(fā)的寡核苷酸帽法(Oligocapingmethod)構(gòu)建的cDNA文庫中，隨機(jī)的克隆全長的cDNA，適合于大規(guī)模、精確的獲得基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的信息(SuzukiY,2002)。本文檔共100頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202384生物信息學(xué)方法大體步驟獲取基因轉(zhuǎn)錄本信息：尋找盡可能長的5‘端cDNA基因CpG島分析：采用網(wǎng)絡(luò)在線軟件，綜合評價有關(guān)CpG島、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及預(yù)計起始位點(diǎn)下游的信息，對基因轉(zhuǎn)錄起始作出預(yù)測。啟動子區(qū)域預(yù)測本文檔共100頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202385生物信息學(xué)方法常見的網(wǎng)上在線生物信息學(xué)軟件：http://http://=Human&db=hg17&hgsid=41271104http:///……本文檔共100頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202386生物信息學(xué)方法實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建質(zhì)粒：根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建5‘和3’缺失片段作為候選啟動子區(qū)域，設(shè)計引物。以正常人基因組DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增各片段，酶切后連入基本載體中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞：分別設(shè)立陰性、陽性和內(nèi)對照。測定轉(zhuǎn)錄活性確定其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)本文檔共100頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202387寡核苷酸帽法（OligoCapingApproach）

傳統(tǒng)的cDNA克隆化技術(shù)的缺點(diǎn)

本文檔共100頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202388寡核苷酸帽法（OligoCapingApproach）全長cDNA的克隆

本文檔共100頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202389寡核苷酸帽法（OligoCapingApproach）全長cDNA文庫的構(gòu)建

本文檔共100頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期六\2點(diǎn)16分6/21/202390啟動子區(qū)SNPs功能研究方法DNA-蛋白結(jié)合體外檢測（Invitro）凝膠遷移率變動試驗(yàn)（EMSA）DNaseI足跡試驗(yàn)瞬時轉(zhuǎn)染（Transienttransfection）

CATassayLuciferaseassay體內(nèi)測定其功能（Invivo）采用具有不同基因型和與表型相關(guān)的細(xì)胞基因組足跡試驗(yàn)：硫酸二甲酯（dimethylsulfate，DMS）、哌啶裂解（piperidinecleavage）染色質(zhì)免疫沉淀（c