分光光計(jì)的使用

分光光度計(jì)的使用本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分主要內(nèi)容１、分光光度法的概念２、分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與原理３、分光光度計(jì)的使用４、實(shí)驗(yàn)操作（CuSO4溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制）本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分分光光度法的概念分光光度法：是利用物質(zhì)特有的吸收光譜，進(jìn)行物質(zhì)鑒定及測(cè)定其含量的一種分析技術(shù)。也稱(chēng)為吸收光譜法。是光譜分析技術(shù)中最常見(jiàn)的一種，應(yīng)用最多的是紫外及可見(jiàn)分光光度法。特點(diǎn)：靈敏、精確、快速和簡(jiǎn)便。應(yīng)用：生物化學(xué)微量物質(zhì)定量分析測(cè)定研究中廣泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測(cè)。光譜范圍：200～1000nm。本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分分光光度法的概念紅外分光光度計(jì):大于760nm的紅外光區(qū)可見(jiàn)光分光光度計(jì):400～760nm的可見(jiàn)光區(qū)紫外分光光度計(jì):

200～400nm的紫外光區(qū)分光光度計(jì)的分類(lèi)本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分722E可見(jiàn)分光光度計(jì)本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分722E可見(jiàn)分光光度計(jì)本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)光源單色光器吸收池檢測(cè)系統(tǒng)鎢絲燈氫燈氘燈棱鏡衍射光柵玻璃比色杯石英比色杯硒光電池光電管光電倍增管本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分當(dāng)一束單色光透過(guò)溶液時(shí)部分被吸收部分被反射部分被透過(guò)IrIaI入射光

I0出射光I比色皿吸收杯反射光

IrIa吸收光分光光度計(jì)基本原理本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分Ｉ/I0表示光線透過(guò)溶液的程度,稱(chēng)為透光度,用T表示；－IgT表示溶液對(duì)光線的吸收程度，用吸光度（A）表示。即I0CIA＝－IgT＝－IgII0←L→

本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分Lambert-Beer定律（光吸收定律）Lambert定律：A＝K1LBeer定律：A＝K2C

Lambert-Beer定律：當(dāng)一束單色光垂直通過(guò)一均勻的溶液時(shí)，溶液的吸光度A，與溶液的濃度C及溶液的厚度L成正比。即A＝KCL其中：A－吸光度K－為消光常數(shù)，表示物質(zhì)對(duì)光線吸收的能力，受物質(zhì)種類(lèi)和光線波長(zhǎng)的影響C－溶液的濃度L－溶液的厚度本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分Lambert-Beer定律的應(yīng)用1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測(cè)定物的含量用一已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和一個(gè)未知濃度的待測(cè)溶液同樣處理顯色，測(cè)定吸光度，根據(jù)Lambert-Beer定律得：A1=K1C1L1A2=K2C2L2

因?yàn)镵1=K2L1=L2

所以C2=A2A1×C1本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分Lambert-Beer定律的應(yīng)用2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定物含量先配制一系列已知濃度的測(cè)定物溶液，按要求方法處理顯色，在最大吸收波長(zhǎng)（λmax）處讀取各管的吸光度，以各管吸光度A為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度C為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后進(jìn)行測(cè)定時(shí)，待測(cè)樣品以相同條件在λmax處讀取吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得該待樣品的濃度。

本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分吸光度A蛋白質(zhì)濃度（μg/ml）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（雙縮脲法：λ＝540nm）0.20.40.6....40801201600本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分722E分光光度計(jì)使用基本操作：（示教）

通電→儀器自檢（BLA）→預(yù)熱20min→設(shè)定波長(zhǎng)→方式設(shè)定（MOOD→T（或A）

→儀器調(diào)“0.000”(將遮光杯）置入光路，在T方式下按“%T”鍵，→儀器自動(dòng)校正后顯示“0.000→參比液調(diào)“0.000”A

→樣品測(cè)定→讀取“A”。

本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分722E分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)：1、預(yù)熱----保證儀器準(zhǔn)確穩(wěn)定；2、比色皿的清潔----待測(cè)液潤(rùn)洗、沖洗；3、比色皿配套----比色皿不能隨意；4、比色皿內(nèi)盛液體量----2/3，有液體，應(yīng)用擦鏡紙拭干，以保證光路通過(guò)時(shí)不受影響；5、拿放比色皿----應(yīng)持其“毛面”，杜絕接觸光路通過(guò)的“光面”；6、溶液濃度要適當(dāng)：吸光度讀數(shù)處于0.1～0.7范圍內(nèi)為宜，否則誤差較大，要適當(dāng)調(diào)整濃度。7、分光光度計(jì)連續(xù)使用一般不超過(guò)2h。

本文檔共18頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\1點(diǎn)52分實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：CuSO4溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制操作步驟：1、用30%CuSO4溶液配制10%、15%、20%、25%、30%的CuSO