四環(huán)素及其衍生物誘導(dǎo)表達(dá)的pTet

四環(huán)素及其衍生物誘導(dǎo)表達(dá)的pTetOn肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的建立【摘要】目的：構(gòu)建可受四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控的高表達(dá)外源基因的真核表達(dá)體統(tǒng)A549pTetOn細(xì)胞系。用于F10基因的功能研究。方法：將pTetOn質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,利用G418的藥物選擇特性,對轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選后的克隆用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化,單克隆分別擴增后,瞬時轉(zhuǎn)染pTREluc(編碼熒光素酶蛋白)質(zhì)粒,Dox誘導(dǎo)表達(dá)后,檢測熒光素酶活性,逐一篩選四環(huán)素調(diào)控高表達(dá)外源基因的A549pTetOn細(xì)胞株。結(jié)果：成功構(gòu)建了一株受Dox調(diào)控的高表達(dá)低背景的A549pTetOn細(xì)胞株。結(jié)論：篩選的A549細(xì)胞為F10基因表達(dá)能被pTeton誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控的細(xì)胞系,為研究F10基因功能提供了理想的細(xì)胞模型。適合在此基礎(chǔ)上對F10基因進(jìn)行深入的研究。

【關(guān)鍵詞】四環(huán)素;F10基因;基因調(diào)控

F10基因是新克隆的在葡萄胎中表達(dá)上調(diào)的功能未知的新基因［1］，在大多數(shù)基因治療或研究基因功能時,多數(shù)轉(zhuǎn)基因都是持續(xù)表達(dá)的,沒有表達(dá)量和表達(dá)時間的調(diào)控。很多情況下,這種持續(xù)表達(dá)外源基因不論是基因功能研究還是基因治療都存在很大局限。pTetOn基因表達(dá)系統(tǒng)是1992年Gossen［2］等設(shè)計的一種受四環(huán)素調(diào)控外源基因表達(dá)的高效真核表達(dá)體系，該系統(tǒng)有兩種表達(dá)質(zhì)粒即調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成,調(diào)節(jié)質(zhì)?？杀磉_(dá)一種融合蛋白稱四環(huán)素反應(yīng)轉(zhuǎn)錄活化因子(Tetresponsivetranscriptionalactivator,tTA),該因子可與反應(yīng)轉(zhuǎn)錄的四環(huán)素反應(yīng)性元件(Tetresponsiveelement,TRE)結(jié)合。在沒有四環(huán)素(tetracycline)或其衍生物強力霉素存在的情況下,引起插入啟動子下游目的基因的高效表達(dá)。隨著四環(huán)素濃度的增加,基因的表達(dá)以一種劑量依賴性的方式逐漸關(guān)閉直至為零。1995年Gossen等通過改變tTA的氨基酸順序構(gòu)建了受四環(huán)素正性調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng),稱Teton基因表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)受四環(huán)素的作用剛好與Tetoff系統(tǒng)相反,即在沒有四環(huán)素的情況下表達(dá)水平為零。而在加入四環(huán)素或強力霉素后目的基因高效表達(dá)。Tetoff、Teton基因表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是目前最為理想的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。與目前所有的真核基因表達(dá)系統(tǒng)比較,該系統(tǒng)具有嚴(yán)密性、特異性、高效性等優(yōu)點［3］?；诖讼到y(tǒng)的原理，我們將pTeton基因表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)質(zhì)粒pTeton轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞系，篩選得到穩(wěn)定克隆后，再導(dǎo)入報道質(zhì)粒pTRELuc,通過檢測熒光素酶的活性，篩選、建立了一株能高水平誘導(dǎo)、低背景表達(dá)的A549細(xì)胞系，為下一步研究F10基因的定量表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、中的作用提供理想的細(xì)胞模型。

1材料與方法

質(zhì)粒

pTetOn、pTRELuc、DOX、Lipofectamin2000、無四環(huán)素污染的胎牛血清購自Clongtech公司。G418、DMEM購自Gicol公司，LuciferaseAssaySystem為Promega公司的產(chǎn)品。

細(xì)胞系及培養(yǎng)條件

肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640的培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

建立表達(dá)pTetOn的穩(wěn)定克隆

Lipofectamin2000介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24h細(xì)胞種于6孔板，待細(xì)胞生長至90%～95%的融合度時開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時備兩個Eppendorf管，每管加入250μl無血清的RPMI1640培養(yǎng)液，其中的一管再加pTetOn質(zhì)粒3μg,另一管加入Lipofectamin20008μg，待Lipofectamin2000室溫孵育5min后，混合兩管，室溫放置5min。然后將500μl混合液加于2mL完全培養(yǎng)基6h,更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至克隆形成,挑選單克隆，經(jīng)過96孔、24孔及12孔細(xì)胞培養(yǎng)板傳代至25ml培養(yǎng)瓶，然后擴大培養(yǎng)備用。

質(zhì)粒pTRELuc瞬間轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞

用有限稀釋法將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pTetOn的A549克隆(A549pTetOn)單克隆化。用%胰酶消化A549pTetOn克隆,制成30個/ml的細(xì)胞懸液接種于10塊96孔板,每孔接種100μl細(xì)胞懸液。2周后挑選生長狀況良好的單克隆(克隆編號)從96孔板逐步擴增到6孔板里;細(xì)胞豐度達(dá)90%時,將每孔的細(xì)胞消化后平均接種在兩個直徑為35mm的培養(yǎng)皿里,分別記作A和B,A皿細(xì)胞保種;用脂質(zhì)體法將pTREluc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B皿細(xì)胞,48h后將轉(zhuǎn)染的B皿細(xì)胞消化平均接種在兩個535mm的培養(yǎng)皿里,分別記作B1和B2。B1皿細(xì)胞培養(yǎng)在含有1μg/mlDox的全培液里,B2皿細(xì)胞不加Dox作對照,48h后檢測熒光素酶活性。

熒光素酶活性檢測

按LuciferaseAssaySystem的說明書的方法，用PBS洗24孔板中待分析的細(xì)胞2次，然后每孔加入100μl,收集細(xì)胞裂解液，置于冰上，旋渦震蕩15s，4℃,12000rpm2min,每個樣品取10μl蛋白裂解液，加入50μlLuciferaseAssayReagent,迅推入單光子儀中測定2s熒光素酶，延遲時間為10s。

誘導(dǎo)倍數(shù)計算

誘導(dǎo)倍數(shù)按下列公式計算:誘導(dǎo)倍數(shù)=+Dox/-Dox誘導(dǎo)倍數(shù)20者為高表達(dá)克隆。

2結(jié)果

A549TetOn

單一克隆的建立Lipofectamin2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pTetOn后，由于質(zhì)粒帶表達(dá)neo基因的G418抗藥性，加入G418篩選,1周后對照組細(xì)胞全部死亡而轉(zhuǎn)染pTetOn的克隆開始出現(xiàn),說明轉(zhuǎn)染成功;2周后抗性克隆隆輪廓清晰,克隆與克隆間的零散細(xì)胞幾乎全部死亡,表明都為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pTetOn的A549克隆,命名為A549pTetOn細(xì)胞。有限稀釋法將A549pTetOn細(xì)胞進(jìn)行單克隆化。1星期后96孔里克隆出現(xiàn),顯微鏡下逐孔觀察,排除多克隆的孔,標(biāo)記單克隆的孔并編號,共挑出10個單克隆,編號從～。

高誘導(dǎo)倍數(shù)的A549pTetOn克隆的挑選

A549pTetOn細(xì)胞通過瞬時轉(zhuǎn)染熒光素酶基因進(jìn)行篩選。分別將pTREluc質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染10個A549pTetOn克隆,通過分析熒光素酶活性,從中挑選出1株高誘導(dǎo)低背景表達(dá)的細(xì)胞株即8號,導(dǎo)倍數(shù)為,名為A549pTetOn(2)。從圖2中看出A549TetOn轉(zhuǎn)染pTREluc后,對照組(不加Dox)熒光素酶活性很低,即表達(dá)較低水平的外源基因；實驗組熒光素酶活性較高,即高表達(dá)外源基因。從圖3看出A549TetOn誘導(dǎo)倍數(shù)最高為。所以8號即為我們需要的低背景高表達(dá)的細(xì)胞株。

3討論

隨著人類基因組的順利完成，越來越多的新基因被發(fā)現(xiàn)并定位?；蚬δ苎芯砍蔀樯茖W(xué)領(lǐng)域的重大課題。這一領(lǐng)域研究是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)和健康產(chǎn)業(yè)的,蘊藏著巨大的產(chǎn)業(yè)化潛能和效益,并與人類的健康息息相關(guān)。但如何對新基因的功能進(jìn)行研究卻是一個棘手的問題，其中如何定時定量表達(dá)特定基因來研究不同表達(dá)水平下的作用一直是一個難題。傳統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)的方法常依賴于熱休克、激素或重金屬等的基因表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng),但由于這些系統(tǒng)存在高本底和多嗜效應(yīng)等缺陷,極大地限制了它們的和［4,5］。近年來發(fā)展的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)克服了上述不足。Tetoff、Teton系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代以來Gossen和Bujard等創(chuàng)建的一種利用原核調(diào)控元件在真核細(xì)胞中定量并特異地控制外源基因表達(dá)的體系。該體系由大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素阻遏操縱子的兩個部件(四環(huán)素阻遏蛋白和四環(huán)素操縱子序列與四環(huán)素及其衍生物doxycycline(Dox)組成。具有如下優(yōu)點：①可調(diào)控性：四環(huán)素為外源基因表達(dá)的開關(guān),調(diào)控外源基因的表達(dá)；②專一性：由于其調(diào)控元件為原核生物調(diào)控序列,不調(diào)控真核生物內(nèi)源性基因的表達(dá)；③誘導(dǎo)劑廉價無毒副作用；④誘導(dǎo)時間短,無泄漏表達(dá)且表達(dá)量高,表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CMV啟動子［6］。Teton系統(tǒng)具有快速激活基因,誘導(dǎo)動力學(xué)受體內(nèi)Tet的影響相對較小,能更精確的進(jìn)行目的基因的調(diào)控,使用更為方便經(jīng)濟(jì)。所以,Teton系統(tǒng)已被成功的應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因鼠、基因治療［7～10］。本研究將pTeton基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,G418篩選8～10d后形成Teton陽性克隆,由于pTeton基因中表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(r)tTA在A549細(xì)胞中整合位點的不同,導(dǎo)致不同陽性克隆表達(dá)(r)tTA蛋白的量存在很大差異,只有高表達(dá)(r)tTA的陽性克隆才有可能有較高的誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)［11］。因此,我們利用質(zhì)脂體通過瞬時轉(zhuǎn)染熒光素酶基因(pTREluc)對篩選出的Teton陽性克隆進(jìn)行功能鑒定,用以篩選出具有高誘導(dǎo)、低背景的Teton基因陽性A549細(xì)胞株,在Dox的作用下篩選出8號為高誘導(dǎo)且低背景的陽性A549細(xì)胞株,從圖2、圖3中可見不同的細(xì)胞株在dox的作用下熒光素酶表達(dá)存在很大差異,其中8號誘導(dǎo)倍數(shù)為倍,其誘導(dǎo)倍數(shù)大于20倍,所以8號細(xì)胞株為較理想的誘導(dǎo)細(xì)胞株。如果將目的基因?qū)朐摷?xì)胞株,將可能表現(xiàn)出較低的背景和20倍以上的目的基因誘導(dǎo)表達(dá)。有文獻(xiàn)報道Teton系統(tǒng)可使誘導(dǎo)表達(dá)的目的基因表達(dá)量增高100倍,甚至增高1000倍［12］,在我們的試驗中獲得最高誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)的A549克隆株為倍,分析原因可能與所使用的熒光素酶檢測試劑盒，基因整合位點，細(xì)胞類型等差異有一定的關(guān)系,這有待于今后做進(jìn)一步的研究。我們已初步成功的建立了Teton穩(wěn)定表達(dá)的A549細(xì)胞株,對于深入研究F10基因的生理功能和機制、全面闡述其生物學(xué)意義均具有十分重要的理論和應(yīng)用價值。

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