人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的改進(jìn)及其鑒定

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的改進(jìn)及其鑒定【摘要】目的改進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，提高體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成功率。方法采用5號(hào)帶柄一次性靜脈輸液針灌注消化液，分別用%、%胰蛋白酶和%膠原酶消化臍靜脈內(nèi)膜，比較三種酶液消化的結(jié)果，并在倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)特點(diǎn)，同時(shí)用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果%、%胰蛋白酶和%膠原酶的最佳消化時(shí)間分別為15min，10min，12min。倒置相差顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞為單層生長，鵝卵石樣鑲嵌排列。免疫組織化學(xué)檢測表明細(xì)胞內(nèi)有Ⅷ因子相關(guān)抗原。結(jié)論膠原酶是分離培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的首選消化液，且%膠原酶消化12min獲得的細(xì)胞數(shù)量多，成活率高。

【關(guān)鍵詞】人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)分離改進(jìn)

Improvementofseparation，cultureandidentificationofhuman

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprimaryculturemethodofehdothelialcellsfromhumanumbilicalveinandimprovetherateofsuccessfulculturein%，%trpsinand%collagenasewereinjectedintothehumanumbilicalveinbyusingdisposableveintransfusionneedle，afterwhichtheendothelialcellswereidentifiedbymorphologyandimmunohistochemistryunderinvertedTheculturedcellshadacobblestoneappearancewithastrictmonolayergrowthandhadⅧrelatedantigen.Therearemanyendothelialcellsafterdigestedby%，%trpsinand%collagenasefor15minutes，10minutes，12minutesThecollagenasewasthebestchoicetoisolateehdothelialcellsfromhumanumbilicalvein.

【Keywords】humanumbilicalveinendothelialcellscellcultureseparationimprovement

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多種生理功能，能產(chǎn)生和分泌許多生物活性物質(zhì)，在維持血管舒縮，抗凝血等方面起重要作用。體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的成功培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細(xì)胞功能及其在各種疾病發(fā)生發(fā)展中所起作用的基礎(chǔ)。本文報(bào)告利用健康產(chǎn)婦正常娩出的胎盤端游離臍帶，采用改進(jìn)的灌流消化法［1］分離臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成功傳代培養(yǎng)并予鑒定，方法可靠，簡便易行，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)行。

1材料與方法

標(biāo)本采集在無菌條件下取正常妊娠足月分娩的新生兒臍帶后，去除臍帶血管中的殘余血液，放入含青、鏈霉素的磷酸鹽緩沖液PBS中，6h內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)。

試劑RPMI1640培養(yǎng)基，新生小牛血清，Ⅰ型膠原酶，胰蛋白酶(美國GIBCO公司)，兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測試劑盒。

儀器Ⅱ級(jí)生物安全柜，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，倒置熒光顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

試劑配制RPMI1640完全培養(yǎng)液：20%新生小牛血清，80%RPMI1640，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素。Ⅰ型膠原酶溶液：用不含Ca2+、Mg2+的Hanks液配制，μm濾膜濾過除菌，保存于-20℃。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)無菌條件下取新生兒臍帶，在Ⅱ級(jí)生物安全柜內(nèi)剪去鉗痕、血腫、凝血塊阻塞部分，分成20cm一段，采用5號(hào)帶柄一次性靜脈輸液針吸取36℃預(yù)熱雙抗PBS，插入臍靜脈斷端，同時(shí)結(jié)扎固定針體，反復(fù)將靜脈內(nèi)殘血沖洗干凈，再用血管鉗夾閉臍帶另一端，然后分別注入所配制%、%胰蛋白酶和%膠原酶消化液，使管腔充盈，37℃，作用6、8、10、12、15、17min；松開一端血管鉗，收集臍靜脈內(nèi)的消化液，然后注入含10%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液再次沖洗管腔，以獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)待細(xì)胞生長成單層細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，然后加入%胰蛋白酶/%EDTA混合消化液約2ml，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，用Hanks液洗一次，再加入RPMI1640培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打混勻，按1：2比例接種傳代。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長率的測定具體方法參照“細(xì)胞培養(yǎng)”［2］，選擇第一代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共培養(yǎng)8d。每天取3孔細(xì)胞，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，取平均值，繪制生長曲線。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鑒定

形態(tài)學(xué)利用倒置相差顯微鏡觀察活體細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。

Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測在24孔培養(yǎng)板內(nèi)放置無菌蓋玻片1cm×1cm，將內(nèi)皮細(xì)胞懸液接種于蓋玻片上，待內(nèi)皮細(xì)胞長至匯合狀態(tài)時(shí)，取出蓋玻片，用PBS沖洗蓋玻片，放入100%丙酮中固定15min，用PBS沖洗3次，每次2min，滴加3%的H2O2室溫孵育8min，PBS沖洗3次，每次2min，滴加兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多抗工作液，放入濕盒內(nèi)，4℃過夜，同時(shí)另一蓋玻片上不加一抗作陰性對(duì)照。次日，用PBS沖洗3次，每次2min，滴加辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，用PBS沖洗3次，每次2min，用DAB底物混合工作液顯色，顯微鏡下觀察，待出現(xiàn)特異性染色后，終止顯色，進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明，封片。

2結(jié)果

培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為單層生長，呈短梭狀或鵝卵石樣鑲嵌排列。原代培養(yǎng)時(shí)，接種于一次性培養(yǎng)瓶后3h開始貼壁。最初細(xì)胞呈圓形，單個(gè)或聚集成團(tuán)，后逐漸伸展呈長梭形，胞漿豐富，胞核清晰可見，為圓形或橢圓形，細(xì)胞間可見相互連接。5d后，細(xì)胞基本匯合。傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞生長旺盛，有時(shí)可見多核細(xì)胞，傳至第8代時(shí)，細(xì)胞變形，呈纖維化，不能形成單層生長。

Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢測，顯微鏡下觀察細(xì)胞漿內(nèi)可見棕色顆粒，核周密集，而對(duì)照細(xì)胞內(nèi)未見著色。

細(xì)胞生長曲線內(nèi)皮細(xì)胞接種培養(yǎng)后，第1d細(xì)胞計(jì)數(shù)略有減少；第2d開始生長，但速度較慢；第3d生長速度加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期；4～6d，細(xì)胞增殖仍然很旺盛，維持在對(duì)數(shù)生長期；7～8d，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和，產(chǎn)生接觸抑制，進(jìn)入停滯期。細(xì)胞倍增時(shí)間為72h。見圖1。不同酶消化情況比較見表1。

圖1HUVEC生長曲線

表1不同酶消化情況比較

注：內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)≤10/250倍視野；內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)介于10～100/250倍視野之間；內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)≥100/250倍視野

3討論

本實(shí)驗(yàn)選用臍帶作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的來源，不僅取材方便，且臍靜脈在很多方面具有與動(dòng)脈相似的生物學(xué)特性。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外生長能力較差，原代培養(yǎng)不易成功。以往主要是采用機(jī)械分離法，將臍靜脈剪開，用手術(shù)刀背等刮取內(nèi)皮細(xì)胞或使用帶有尼龍篩的分離管［3］，但這一方法很難掌握力度，用力太輕，取得的細(xì)胞數(shù)量很少；用力太重，易獲得其他雜細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等，而且此方法易損傷內(nèi)皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了5號(hào)帶柄一次性靜脈輸液針固定灌流消化法，獲得的細(xì)胞較純，且能較好地保持其生物活性。實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果表明影響原代內(nèi)皮細(xì)胞成功分離培養(yǎng)的因素主要有兩點(diǎn)：(1)材料一定要新鮮。有研究表明，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞離體后，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)一些物質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生變化。健康產(chǎn)婦新生兒臍帶最遲應(yīng)在12h內(nèi)處理，處理前臍帶可放在加有雙抗的PBS中，4℃保存。時(shí)間超過12h后，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)水腫，變性，活力下降，甚至無法存活。有研究表明臍帶離體3h內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞存活率為90%，離體24h后僅有50%存活［4］。(2)掌握消化酶的種類、濃度和消化時(shí)間甚為關(guān)鍵。大部分學(xué)者消化時(shí)選用胰蛋白酶或膠原酶。我們分別比較了%、%胰蛋白酶，%膠原酶三種不同濃度酶液的消化能力，結(jié)果表明，在37℃培養(yǎng)條件下，%胰蛋白酶消化15min；%胰蛋白酶消化10min；%膠原酶消化12min為最佳消化時(shí)間。在此條件下，分離出的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量多，雜細(xì)胞污染少，且細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。胰蛋白酶消化時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷較大；而膠原酶對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，能使上皮細(xì)胞與膠原組織成功分離，且不損傷內(nèi)皮細(xì)胞，因此膠原酶被認(rèn)為是最理想的血管內(nèi)皮細(xì)胞分離酶。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)、體外的增殖緩慢，在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入適量生長刺激因子，則可明顯促進(jìn)細(xì)胞生長［5］。

人體其它部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞來源困難，因此本臍靜脈內(nèi)皮原代細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的改進(jìn)，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，簡便易行，有利于獲得所需的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图?xì)胞，為進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性及其與各種疾病的關(guān)系提供幫助。

【參考文獻(xiàn)】

1鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù).北京：北京出版社，2001，125-126.

2司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng).西安：世界圖書出版公司，2004，241-243.

3PiebeM，PaulsenF，JalnkeT，etbrushcatheterabrasionmethodfortheisolationandcultureofhumanumbilicalveinendothelialinvitroresults，2001，173(10)：955-958.

4程滿根.血管內(nèi)皮細(xì)胞