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環(huán)肽的合成方法
多肽藥物在治療上的重要性,越來(lái)越引起廣大藥學(xué)工作者的重視。根據(jù)肽鏈的構(gòu)成可將多肽分為同聚肽和雜聚肽兩大類(lèi),前者完全由氨基酸組成,后者是由氨基酸部分和非氨基酸部分組成的,如糖肽。根據(jù)肽鍵的結(jié)構(gòu)又分為直鏈肽和環(huán)肽。其中直鏈肽的研究最為廣泛和深入,尤其在直鏈肽的合成技術(shù)方面無(wú)論是液相法還是固相法都已成熟。雖然許多直鏈肽體外具有很好的生物活性和穩(wěn)定性,但是進(jìn)入體內(nèi)后活性很快消失。因?yàn)轶w內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,存在各種各樣的酶。直鏈肽在酶的作用下很快降解,導(dǎo)致活性喪失[1-2]。另外,直鏈肽在液相里的構(gòu)象柔性使得不大容易符合受體的構(gòu)象要求。這些不利因素造成多肽藥物仍有許多問(wèn)題有待解決。為了得到生物活性優(yōu)秀半衰期長(zhǎng),受體選擇性高的多肽,文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)很多多肽改造的方法,其中包括將直鏈肽改造成環(huán)肽[3-8]。這種大環(huán)分子具有明確的固定構(gòu)象,能夠與受體很好地契合,加上分子內(nèi)不存在游離的氨端和羧端使得對(duì)氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低[10-12]。一般地說(shuō),環(huán)肽的代謝穩(wěn)定性和生物利用度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直鏈肽[13]。鑒于環(huán)肽的諸多優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)對(duì)多肽研究的熱點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到環(huán)肽的合成和生物評(píng)價(jià)上。
根據(jù)環(huán)肽的環(huán)合方式又分為首尾相連環(huán)肽、側(cè)鏈和側(cè)鏈相連環(huán)肽(Sidechain-to-sidechain)[14]、側(cè)鏈和端基相連環(huán)肽[15]、含二硫橋的環(huán)肽[16-18]、以及含有其他橋連結(jié)構(gòu)的環(huán)肽[19-23]。從合成方法上講,首尾相連的環(huán)肽的合成難度最大。因?yàn)榄h(huán)肽的前體-直鏈肽的肽鍵具有很強(qiáng)的p鍵特征,分子更偏愛(ài)形成反式構(gòu)象,呈舒展?fàn)顟B(tài),造成屬于反應(yīng)中心的端基的羧基和氨基在空間上距離較遠(yuǎn),不利于發(fā)生分子內(nèi)縮合反應(yīng),有利于分子間縮合。
首尾相連的環(huán)肽通常是N端和C端游離的直鏈肽在稀溶液中由羧基和氨基形成酰氨鍵來(lái)合成。直鏈前體中的氨基酸種類(lèi)和數(shù)目對(duì)成環(huán)的難易程度和環(huán)肽的收率起著至關(guān)重要的作用。甘氨酸、脯氨酸或D-構(gòu)型氨基酸具有誘導(dǎo)b-轉(zhuǎn)角的作用,常被認(rèn)為可增加成環(huán)的可能性和收率[24-25]。1.合成首尾相連環(huán)肽的經(jīng)典方法
合成首尾相連環(huán)肽的經(jīng)典方法是在稀溶液(10-3~10-4M)中,將保護(hù)的線性前體選擇性地活化并環(huán)合。常用活潑酯法和迭氮法。
活潑酯法
活潑酯法中活化羧基和環(huán)合反應(yīng)是分兩步進(jìn)行的?;顫婖ハ鄬?duì)很穩(wěn)定,一般不需要純化可直接用于環(huán)合反應(yīng)。幾乎所有可用于偶聯(lián)反應(yīng)的活潑酯都可用于合成環(huán)肽,主要有對(duì)硝基酚酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯、五氟苯酯和2,4,5-三氯苯酚酯。線性多肽的C端羧基與對(duì)硝基酚、N-羥基琥珀酰亞胺、五氟苯酚或2,4,5-三氯苯酚,在DCC或其他縮合劑存在下,于低溫反應(yīng),很容易得到相應(yīng)的活潑酯。這種N端通常帶有BOC或Z保護(hù)的活潑酯在酸性條件下脫去保護(hù)基,形成活潑酯的氫鹵酸鹽,在弱堿性稀溶液中,如在吡啶,DMF或二氧六環(huán)一類(lèi)介電常數(shù)較大的溶劑中,保持pH8~9,加熱或室溫?cái)嚢钄?shù)小時(shí)至數(shù)日,最終可得到環(huán)肽。
對(duì)硝基酚酯法
對(duì)硝基酚酯法合成環(huán)肽的通式如Scheme1[26]Cyclo(b-Ala-Phe-Pro)的合成中應(yīng)用了對(duì)硝基酚酯法。Boc-b-Ala-Phe-Pro-OH在乙酸乙酯中與摩爾量對(duì)硝基酚混合,DCC為縮合劑,得到Boc-b-Ala-Phe-Pro-ONp,經(jīng)TFA脫去Boc,以NaHCO3和Na2CO3為堿,二氧六環(huán)為溶劑,室溫反應(yīng),得到收率為32%的環(huán)三肽[27]。對(duì)硝基酚酯法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)硝基酚價(jià)廉易得,缺點(diǎn)是過(guò)量的對(duì)硝基酚不易完全除去,產(chǎn)物不易純化,顏色發(fā)黃。N-羥基琥珀酰亞胺酯法:
該方法原理與對(duì)硝基酚法一致,唯一不同點(diǎn)在于線性多肽的C端羧基在縮合劑EDC的存在下與N-羥基琥珀酰亞胺縮合,形成直鏈多肽的N-羥基琥珀酰亞胺酯。應(yīng)用這種方法Toshihisa等在吡啶溶液中合成了cyclo和cyclo,收率分別為15%和12%。二者為非對(duì)映異構(gòu)體,前者具有植物生長(zhǎng)抑制作用,后者卻表現(xiàn)為植物生長(zhǎng)促進(jìn)作用[28]。五氟苯酚酯法:
這類(lèi)活潑酯用于環(huán)肽的合成是近年才發(fā)展起來(lái)的。Joullie在合成天然環(huán)肽生物堿SanjoinineG1和其C11位對(duì)映異構(gòu)體時(shí)在環(huán)合步驟中就應(yīng)用了五氟苯酚酯法。首先以D-絲氨酸為原料,經(jīng)多步反應(yīng)得到環(huán)合前體,用五氟苯酚活化羧基,N端芐氧羰基經(jīng)氫解脫掉后,以4-吡咯烷吡啶為催化劑,在二氧六環(huán)中回流,最終得到兩個(gè)互為異構(gòu)體的混合物,收率分別為27%和22%[29-30],環(huán)合步驟如下
另外,海洋生物環(huán)肽PatellamineB以及對(duì)纖維蛋白酶和絲氨酸蛋白酶有強(qiáng)烈抑制作用的環(huán)肽CyclotheonamideA的環(huán)合步驟也是應(yīng)用了五氟苯酯法,收率分別是20%和53%[31]。
迭氮法
在多肽合成中迭氮法是另一種比較經(jīng)典的方法,這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于很少引起消旋反應(yīng),最早用于直鏈肽的合成,現(xiàn)在常常被用于環(huán)肽的合成[32-34]。具體方法是,把直鏈肽的甲酯,乙酯,芐酯,取代芐酯或其它更活潑的酯通過(guò)肼解的方式生成酰肼,溶于醋酸或鹽酸-醋酸混合溶液,在-5°C左右的溫度下加入1M的亞硝酸鈉溶液,產(chǎn)生的亞硝酸則與酰肼反應(yīng)生成迭氮物。N端游離的直鏈肽迭氮物于4°C攪拌一天再升溫至室溫,可得環(huán)肽。通式如Scheme4
Scheme4.PeptideCyclizationviatheacylazide
Bodansky最早應(yīng)用迭氮法合成了cyclo(D-Ala-D-Ala-Val-D-Leu-Ile),雖然上述環(huán)肽不具有其母體化合物malformin的生物活性,但合成它為應(yīng)用迭氮法合成環(huán)肽開(kāi)辟了前景[35]。
應(yīng)用迭氮法合成環(huán)肽的另一個(gè)成功的例子是內(nèi)皮素拮抗劑的合成。Endothelin(ET)是一種高效的血管收縮劑,由21個(gè)氨基酸殘基組成[36],其受體拮抗劑之一cyclo(D-Trp-D-Asp(OtBu)Fmoc-Ser-D-Val-Leu)的合成過(guò)程[37]DPPA系二苯基磷?;?,是一種穩(wěn)定的液體,沸點(diǎn)157°C,用二苯基磷酰氯和NaN3在丙酮中室溫反應(yīng)很方便地得到,可以直接用作多肽偶聯(lián)的縮合劑[38],近年來(lái)多用于環(huán)肽的合成[39-41]。
Arg-Gly-Asp是多種細(xì)胞外蛋白與整合素相互作用時(shí)被整合素識(shí)別的關(guān)鍵序列,對(duì)含有該序列環(huán)肽的合成報(bào)道很多[42-45]。Kessler等用固相合成儀SP650合成了13個(gè)含RGD序列的線性六肽和七個(gè)含RGD序列的線性五肽,N端和C端均游離的直鏈肽在稀溶液中以DPPA為縮合劑,保持pH~9,反應(yīng)4天,得到相應(yīng)的環(huán)六肽和環(huán)五肽,收率在15%~50%之間。生物活性實(shí)驗(yàn)表明所有的環(huán)六肽對(duì)細(xì)胞粘附的抑制作用均明顯低于線性肽GRGDS。環(huán)五肽中也只有Cyclo(RGDdFV)和Cyclo(RGDFd-V)對(duì)LamininP1的細(xì)胞粘附具有明顯的抑制作用[46-48]。
對(duì)于某些在堿性條件下易分解的目的物,反應(yīng)過(guò)程當(dāng)中應(yīng)用惰性氣體進(jìn)行保護(hù),例如,線性多肽H-Asp(Fmoc)-d-Ser-Phe-D-Phe-Arg-Gly-OH在無(wú)水DMF中,加入5倍量NaHCO3和10倍量DPPA,反應(yīng)66小時(shí),得到收率僅為3%的纖維蛋白原受體拮抗劑Cyclo(Asp-D-Ser-Phe-D-Phe-Arg-Gly);若改變NaHCO3和DPPA用量,并且反應(yīng)過(guò)程中用氬氣保護(hù),反應(yīng)三天,可得到產(chǎn)率高達(dá)39%的上述環(huán)肽.兩種條件下所得收率有如此大的差別,主要原因是目的物在堿性條件下易分解[40]。
以DPPA為縮合劑合成環(huán)肽時(shí),除了用NaHCO3、Na2CO3為無(wú)機(jī)堿外,也常使用KH2PO4。例如能夠與鴉片受體結(jié)合的環(huán)肽Try-C[D-A2bu-Phe-Phe-(LorD)-Leu]的合成中,就使用了KH2PO4這樣的弱堿催化,收率高達(dá)75%[49-50]。用同樣的方法合成Somatostatin的類(lèi)似物Cyclo(Lys-
Phe-D-Trp-Lys-Thy-Phe),收率也達(dá)到了42%[51]。
以DPPA為縮合劑合成環(huán)肽時(shí),有機(jī)堿常用三乙胺[52]、N-甲基嗎啉和二異丙基乙胺,這三種弱堿能夠與有機(jī)溶劑混溶,用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于NaHCO3和KH2PO4,而且NMM和DIEA不易引起消旋。2.環(huán)肽合成中新型縮合劑
羥基-7-氮雜苯駢三唑衍生物
近年來(lái),HoAt類(lèi)多肽合成縮合劑發(fā)展迅速,這類(lèi)縮合劑包括TAPipU[O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-penta-methylenuroniumtetrafluoroborate]、HAPyU[O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-bis(tetramethylene)uroniumhexafluorophosphate]、PyAOP(7-azabenzotriazol-1-yloxyl-trispyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate)和HATU[O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluoro-phosphate]等。使用這些縮合劑不僅反應(yīng)速度快,而且手性不受損害[53-55]。Ehrlich等考察了不同縮合劑對(duì)GnRH衍生物十肽H-Nal-d-Cpa-d-Pal-Glu-Tyr-d-Arg-Leu-Arg-Pro-Lys(Ac)-OH環(huán)合反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)HAPyU和TAPipU是環(huán)肽合成中非常有效的縮合劑,直鏈肽濃度在/L時(shí),30分鐘內(nèi)環(huán)合反應(yīng)即完成。反應(yīng)當(dāng)中,縮合劑一般需要過(guò)量10%以保證反應(yīng)完全。若增加溶液中線性多肽的濃度可以促使環(huán)合反應(yīng)更快地發(fā)生。例如,線性十肽濃度在時(shí),加入上述兩種縮合劑,兩分鐘內(nèi)即發(fā)生環(huán)合;此外,令人驚奇的是,即使線性多肽濃度高達(dá)時(shí),也未發(fā)生分子間縮合反應(yīng),這表明在首尾和側(cè)鏈環(huán)合反應(yīng)中,稀溶液也許是不必要的。比較HAPyU和TAPipU在合成過(guò)程中對(duì)環(huán)肽消旋的影響,發(fā)現(xiàn)HAPyU更少引起消旋化反應(yīng),以TAPipU為縮合劑合成環(huán)六肽Cyclo[Val-Arg-Lys(Ac)-Ala-Val-Tyr]時(shí),收率為25%,引起末端酪氨酸的消旋化達(dá)8%,若以HAPyU為縮合劑時(shí),30分鐘內(nèi)可得到55%收率的環(huán)六肽,D-構(gòu)型酪氨酸-異構(gòu)體不足%[56-57]。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證HoAt類(lèi)縮合劑在合成環(huán)肽中的優(yōu)勢(shì),Ehrlich選擇了使用一般縮合劑難于得到的thymopentin類(lèi)似物作為研究對(duì)象,對(duì)HAPyU、PyAOP和HATU就環(huán)合的產(chǎn)率及環(huán)合過(guò)程中發(fā)生的二聚和C端酪氨酸殘基構(gòu)型的改變進(jìn)行了系統(tǒng)的比較。結(jié)果表明,在線性多肽濃度為/L,DIEA三倍過(guò)量,HAPyU為縮合劑時(shí),單體環(huán)肽的收率最高,達(dá)到82%,未檢測(cè)到D-Tyr-異構(gòu)體和二聚體,說(shuō)明這一條件是合成thymopentin類(lèi)似物的最適條件,其他縮合劑在環(huán)合時(shí),一則收率偏低,甚至不反應(yīng),二則造成酪氨酸消旋化。雖然延長(zhǎng)時(shí)間可以增加收率,但隨之而來(lái)的是酪氨酸消旋化的增加[58]。
Phakellistatin5[59]是一種從海綿中提取得到的環(huán)七肽,Pettit等采用固相法得到直鏈前體后,以PyAOP為縮合劑,得到收率為28%的R-Asn-Phakellistatin5。
Mink等人以N端Boc保護(hù)的天冬氨酸和絲氨酸芐酯為原料,采用液相法經(jīng)多步反應(yīng)得到具有多個(gè)惡唑結(jié)構(gòu)的直鏈前體,N端和C端經(jīng)氫解和酸脫保護(hù)后以HATU為縮合劑,得到了平面結(jié)構(gòu)的DolastatinE類(lèi)似物。這種具有多種功能團(tuán)的化合物可用于超分子化學(xué)和組合化學(xué)[60-62]。
此外,具有輔助放射性同位素進(jìn)入血小板的載體功能的DolastatinD類(lèi)似物Cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(orTyr)][63],以及對(duì)血小板生長(zhǎng)因子具有拮抗作用的血小板生長(zhǎng)因子B鏈序列類(lèi)似物Cyclo(Arg-Lys-Iles-Gla-Ile-Val-Arg-Lys-Lys-Cys)也是采用HATU為縮合劑進(jìn)行環(huán)合反應(yīng)得到的[64]。
從以上給出的例子可以看出,環(huán)肽合成的縮合劑不象DCC那樣具有普遍的適用性。不同的環(huán)肽合成要求不同的縮合劑。TBTU和HBTU
TBTU和HBTU最早是用于合成線性二肽和三肽的苯駢三氮唑類(lèi)縮合劑。使用過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)這兩種化合物在某些環(huán)肽的合成中表現(xiàn)出快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。Knorr等[65]以TBTU/HoBt為縮合劑在DMF中得到了Cyclo(Tyr-Asp-Phe-Phe-Ser/Phr-Ala),Zimmer等人應(yīng)用HPLC技術(shù)比較了TBTU/HOBt和DPPA/NaHCO3復(fù)合縮合劑在這種環(huán)六肽合成中的應(yīng)用,結(jié)果表明前者反應(yīng)速度非常快是后者的5~70倍[66]。
從海洋生物海綿中提取分離得到的phakellistation2,具有抑制鼠P388淋巴細(xì)胞和人癌細(xì)胞增殖的作用。由于人工從海綿中提取這種環(huán)肽比較困難,Pettit等對(duì)這種化合物進(jìn)行了全合成,以便深入研究其生物活性。其中關(guān)鍵的環(huán)合步驟分別采用TBTU,BOP-Cl,PyBrOP和TBTU/HOBt為縮合劑,經(jīng)數(shù)日,得到收率不等的產(chǎn)物。其中TBTU為縮合劑時(shí)收率最高,達(dá)到55%。這種人工合成的環(huán)肽雖然在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與天然肽結(jié)構(gòu)一致,但二者的生物活性卻差異甚大,合成的環(huán)肽對(duì)P388白血病淋巴細(xì)胞的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然環(huán)肽,原因可能是二者的構(gòu)象不同[67]。
在對(duì)生長(zhǎng)激素釋放抑制因子(SRIH)具有高效親和能力的環(huán)六肽MK-678:Cyclo[Phe-(N-Me)Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val]的合成中HBTU充分發(fā)揮了其高效的特點(diǎn)[68-69]。另一種環(huán)六肽Cyclo[hCys-(N-Me)Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val]的合成也是應(yīng)用HBTU為縮合劑,反應(yīng)路線
Bop法
McMurray[70-72]等以Cyclo(Asp-Asn-Glu-Tyr-Ala-Ala-Arg-Gln-D-Phe-Pro)(TyrI+1)為研究對(duì)象,以便確定TyrI+1的哪些位置對(duì)蛋白酪氨酸激酶的親和性是必不可少的,以及哪些氨基酸對(duì)活性貢獻(xiàn)最大,以Bop/HOBt為復(fù)合縮合劑,在1mmol/L濃度下,合成了一系列TyrI+1類(lèi)似物,并經(jīng)磷酸化和親和力實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)6位,7位是芳香類(lèi)氨基酸的Cyclo(Asp-Asn-Gln-Tyr-Ala-Phe-Phe-Gln-D-Phe-Pro)的活性最強(qiáng)[73]。
以往具有RGD序列的多肽的研究多集中在抗血小板聚集方面,隨著對(duì)這一類(lèi)化合物生物活性的深入研究,興奮點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移到含RGD序列多肽抗粘附、抗血管增生和骨質(zhì)疏松等方面,兩種含RGD的Cyclo(RGDRGD)和Cyclo(RGDRGd)(d=D-Asp)以及線性肽RGDRGD選擇性地與aVb3-玻璃體粘連蛋白結(jié)合,在骨再生實(shí)驗(yàn)中均顯示出中等強(qiáng)度的活性,其中兩個(gè)環(huán)肽的合成是以Bop/HOBt為復(fù)合縮合劑,倍過(guò)量的DIEA存在下進(jìn)行的,收率高達(dá)80%[74]。
3.固相法合成環(huán)肽
固相法能夠有效地避免環(huán)合過(guò)程中二聚、多聚等副反應(yīng)的發(fā)生。早在60年代,F(xiàn)ridkin等就應(yīng)用高分子載體來(lái)合成環(huán)肽[75]。線性多肽的C端羧基與樹(shù)脂形成酯鍵而將線性肽掛在樹(shù)脂上,脫去N端保護(hù)基后,以三乙胺中和,室溫12小時(shí)后得到60%~80%收率的環(huán)肽,具體過(guò)程
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的通過(guò)氨基酸側(cè)鏈與樹(shù)脂連接合成環(huán)肽的策略在環(huán)肽合成中應(yīng)用廣泛[76]。對(duì)具有天冬氨酸或谷氨酸殘基的線性多肽,可選擇這兩個(gè)酸性氨基酸殘基的側(cè)鏈羧基為C端,與PAC(烷氧基芐醇)或PAL(烷氧基芐胺)或其他類(lèi)型樹(shù)脂縮合,將線性多肽掛在樹(shù)脂上。主鏈羧基用烯丙基保護(hù)。逐步接肽完成之后脫去N端和C端保護(hù)基,加入縮合劑得到連在樹(shù)脂上的環(huán)合產(chǎn)物。最后用三氟醋酸:茴香硫醚:b-巰基乙醇:苯甲醚混合試劑從樹(shù)脂上切下環(huán)肽,同時(shí)脫去其它側(cè)鏈保護(hù)基。采用這種策略完成了Cyclo(Ala-Ala-Arg-D-Phe-Pro-Glu-asp-Asn-Tyr-glu)的合成,收率為71%[77]。這種方法的局限性在于線性多肽前體中必需包含天冬氨酸或天冬酰氨,谷氨酸或谷氨酰胺[78-80]。對(duì)-硝基苯基甲酮肟聚合物最早被DeGrado和Kaiser作為固相載體用于多肽的固相合成[83]。肽基肟酯在酸性條件下穩(wěn)定,但在氨解的條件下很不穩(wěn)定。利用肟酯能夠氨解的特點(diǎn),Ospay等在合成環(huán)十肽TyrocidineA[84]時(shí)應(yīng)用此法在肟樹(shù)脂上合成直鏈的十肽,N端經(jīng)TFA脫去Boc基后用DIEA中和,使氨基游離,室溫?cái)嚢?4小時(shí)后,得到側(cè)鏈保護(hù)的環(huán)肽,脫去保護(hù)基,純化,得到收率高達(dá)55%
的TA。4.酶法合成環(huán)肽:
在緩沖液中利用蛋白酶合成環(huán)肽也是正在發(fā)展的方法之一。Jackson[85]等報(bào)道了以線性多肽酯的衍生物為底物,通過(guò)酶催化成環(huán)的方法合成了幾個(gè)包含12~25個(gè)氨基酸殘基頭尾相接的環(huán)肽,環(huán)化用的酶Subtiligase是枯草桿菌蛋白酶突變的產(chǎn)物,催化反應(yīng)體系為pH=8的緩沖溶液。用HPLC檢測(cè),收率在30%~80%之間。環(huán)化效率與肽的序列和長(zhǎng)度有關(guān)。利用Subtiligase合成環(huán)肽所需的線性肽的最小長(zhǎng)度是12個(gè)氨基酸殘基,低于此數(shù)將得到水解產(chǎn)物或線性肽二聚產(chǎn)物??赡苁且?yàn)榈陀?2個(gè)殘基的肽底物形成的頭尾相接的空間構(gòu)象不能與酶的活性中心匹配。5.合成環(huán)肽的其它方法
下面介紹幾種比較特殊的環(huán)肽合成方法:
Meuterman[86-87]等人巧妙地將光敏感輔助劑融合在環(huán)肽合成過(guò)程中,這種與常規(guī)合成方法不同的策略,不僅豐富了環(huán)肽合成方法學(xué)的內(nèi)容,也為其他合成工作者提供了想象空間。直鏈五肽H-Ala-Phe-Leu-Pro-Ala-OHH-Ala-Phe-Leu-Pro-D-Ala-OH和H-Phe-Leu-Pro-Ala-Ala-OH在常規(guī)條件下,溶于DMF,使成為10-3~10-4M溶液,加入3倍量Bop為縮合劑,5倍量DIEA作為堿和催化劑,未得到單體環(huán)合化合物,只得到了環(huán)二聚體和環(huán)三聚體。采用光敏輔助劑的方法,將5-硝基-2-羥基芐基和6-硝基-2-羥基芐基以及巰基乙基等光敏結(jié)構(gòu)引入線性肽N端,這些結(jié)構(gòu)中的羥基或巰基與C端羧基成酯后,使得N端與C端在空間位置上更為接近,經(jīng)酰基轉(zhuǎn)移使環(huán)縮小而得到N端連有光敏輔助劑的環(huán)肽,最后經(jīng)光解反應(yīng)脫去光敏輔助劑,得到首尾相連的環(huán)五肽,收率為20%,以Cyclo(Ala-Phe-Leu-Pro-Ala)的合成為例,具體過(guò)程在傳統(tǒng)的環(huán)肽合成方法中,不僅線性肽前體的氨基酸側(cè)鏈一般都需要保護(hù),而且要求反應(yīng)物在溶液中呈高度稀釋狀態(tài),非保護(hù)的氨基酸的環(huán)合無(wú)論是在概念上還是在機(jī)理上都不同于傳統(tǒng)環(huán)合方法,主要特征是酰胺鍵在沒(méi)有活化劑存在下,通過(guò)分子內(nèi)?;D(zhuǎn)移而形成;兩個(gè)反應(yīng)端基在緩沖液中的可逆反應(yīng)造成環(huán)-鏈的結(jié)構(gòu)互變,調(diào)節(jié)和控制環(huán)的形成。這種非保護(hù)環(huán)肽的合成方法避免了煩瑣的保護(hù)和脫保護(hù)步驟以及反應(yīng)液高度稀釋的要求,終產(chǎn)物可直接用于生物活性實(shí)驗(yàn)。
Jame[88-90]等建立了分子內(nèi)轉(zhuǎn)移硫內(nèi)酯化和Ag+離子輔助環(huán)合來(lái)制備非保護(hù)環(huán)肽的方法。對(duì)于N端為半胱氨酸,C端為硫酯的線性多肽,在pH=7的磷酸緩沖液中,巰基與硫酯基生成共價(jià)的硫內(nèi)酯,這種硫內(nèi)酯自發(fā)地經(jīng)過(guò)S原子到N原子?;w移而形成環(huán)肽,如
作者應(yīng)用上述方法合成了一系列N端為半胱氨酸的Cyclo(Cys-Tyr-Gly-Xaa-Yaa-Leu),為了防止二硫橋的形成和加速環(huán)合反應(yīng)的進(jìn)行,反應(yīng)過(guò)程中加入TCEP(三羧基乙基膦),反應(yīng)時(shí)間約為4小時(shí),收率在78%~92%之間,HPLC檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)副反應(yīng)和低聚物。
對(duì)于不含半胱氨酸的線性多肽的環(huán)合,采用親硫的Ag+離子輔助配位柔性的線性多肽的N端氨基與C端硫酯形成一個(gè)環(huán)狀的中間體,通過(guò)熵活化促進(jìn)分子內(nèi)環(huán)合。與硫內(nèi)酯環(huán)合方法原理相似,Ag+離子通過(guò)一種非經(jīng)典環(huán)-鏈結(jié)構(gòu)互變而促使分子內(nèi)環(huán)合的發(fā)生,環(huán)狀中間體如下
應(yīng)用上述方法合成環(huán)肽的具體實(shí)例是Cyclo(Ala-Lys-Try-Gly-Gly-Phe-Leu)的合成。在的醋酸緩沖溶液中加入10%的DMSO作為助溶劑,反應(yīng)5小時(shí)后得到收率為67%的目的物。6.環(huán)二肽的合成:
環(huán)二肽(2,5-哌嗪二酮)是最小的環(huán)肽,許多天然環(huán)二肽化合物都具有明確的生物活性,例如作為抗生素,苦味劑,植物生長(zhǎng)抑制劑以及激素釋放抑制劑等[91-92]。環(huán)二肽結(jié)構(gòu)的特殊性使得這類(lèi)化合物的合成自成體系,通常由N端游離的直鏈肽酯在極性溶劑中回流,便可以很容易地得到目的物。Fischer雖然在甲醇氨中氨解線性二肽甲酯而得到環(huán)二肽,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種方法易引起消旋。Nitecki[93]提出將N端游離的線性二肽甲酯在丁醇和甲苯的混合溶劑中回流合成環(huán)二肽不會(huì)造成消旋。Ueda[94]使用甲醇為溶劑進(jìn)行回流,也得到了很好收率的環(huán)二肽;Cook等人應(yīng)用1,2-乙二醇作為反應(yīng)溶劑,得到了兩種非對(duì)映異構(gòu)體環(huán)二肽,總收率達(dá)%[95]。最近汪有初等報(bào)道了參照Ueda和Cook的方法合成了一系列環(huán)二肽,收率在55%~99%之間,并且通過(guò)生物活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cyclo(Phe-Pro),Cyclo(Ile-Ile)和Cyclo(Met-Met)具有輕微的鈣拮抗效應(yīng),Cyclo(Ala-Ala)和Cyclo(Pro-Pro)則顯示了增強(qiáng)鉀所致的收縮效應(yīng)[96-97]。以上介紹了迄今為止合成首尾相連環(huán)肽的方法。由于環(huán)肽的前體-直鏈肽所包含的氨基酸的數(shù)目和種類(lèi)的千差萬(wàn)別,造成了環(huán)肽合成方法的多樣化。對(duì)某種直鏈肽表現(xiàn)出高效,快速縮合作用的試劑和方法對(duì)另外一種肽鏈就可能變得低效或無(wú)效。因此,根據(jù)目標(biāo)環(huán)肽的序列尋找對(duì)應(yīng)的環(huán)肽合成方法必須通過(guò)認(rèn)真的探索和艱辛的努力。
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