現(xiàn)代生物技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用已

第十二章現(xiàn)代生物技術(shù)在發(fā) 酵工業(yè)中的應(yīng)用第一節(jié)概述第二節(jié)工程菌的發(fā)酵第三節(jié)動植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)第四節(jié)固定化細(xì)胞發(fā)酵本文檔共120頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期一\17點46分第一節(jié)概述生物技術(shù)(biotechnology)，又稱生物工程或生物工藝學(xué)等。它是近代發(fā)展非常迅速的一門綜合性科學(xué)技術(shù)，涉及許多科學(xué)領(lǐng)域。生物技術(shù)是應(yīng)用生物科學(xué)的理論、方法和技術(shù)，按照人們設(shè)計的藍(lán)圖，改良和加工生物或用生物及其制備物作為加工原料，提供所需的生物制品，為人類服務(wù)的綜合性科學(xué)技術(shù)。本文檔共120頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期一\17點46分綜合性科學(xué)技術(shù)知識密集型新產(chǎn)業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域很寬（農(nóng)、工、食、藥等）

本文檔共120頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期一\17點46分發(fā)酵工程是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)，是生物技術(shù)四大支柱的核心，無論傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，如抗生素、氨基酸等，還是現(xiàn)代基因工程產(chǎn)品，如疫苗、人體蛋白質(zhì)等，都需要發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。生物技術(shù)中，當(dāng)前人們最感興趣的是基因工程和細(xì)胞工程，它們是生物技術(shù)的主導(dǎo)領(lǐng)域，也是熱點。發(fā)酵工程和酶工程等也是生物技術(shù)中的重要組成部分。這幾方面的內(nèi)容是相互聯(lián)系和互相促進(jìn)的。本文檔共120頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期一\17點46分1、工程菌的來源

基因工程菌：在生物體外對DNA分子進(jìn)行重新組合，然后克隆到適合的宿主細(xì)胞，進(jìn)行增殖和表達(dá)，所得到的重組菌株即是工程菌。2、生產(chǎn)用工程菌應(yīng)具備條件①產(chǎn)品高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率；分泌型菌株最好；②能利用常用的碳源(如糖蜜、淀粉等)，并可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)；③菌株不致病，也不產(chǎn)生內(nèi)毒素；④發(fā)酵所產(chǎn)生的熱量和需氧量都低，發(fā)酵溫度適當(dāng)；⑤代謝控制容易進(jìn)行；⑥重組DNA穩(wěn)定，不易脫落。第二節(jié)工程菌的發(fā)酵一、工程菌的來源和應(yīng)用本文檔共120頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期一\17點46分3、工程菌的應(yīng)用蛋白類藥物產(chǎn)品：如胰島素、干擾素、生長激素等，還有幾十種正在開發(fā)中。氨基酸生產(chǎn)：如高產(chǎn)的蘇氨酸工程菌。維生素生產(chǎn)：能直接轉(zhuǎn)化葡萄糖為2-酮基-L-古龍酸的工程菌，為維生素C生產(chǎn)開辟了新的途徑?？股厣a(chǎn)：如將頭孢菌素生物合成的限制性擴環(huán)酶基因克隆到產(chǎn)生菌中，使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高了15％。本文檔共120頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期一\17點46分比較成熟的基因工程產(chǎn)品本文檔共120頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期一\17點46分

(一)基因重組細(xì)胞的種類原核：大腸桿菌和枯草桿菌真核：酵母菌和哺乳動物細(xì)胞等。

二、工程菌的培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期一\17點46分

(二)工程菌的培養(yǎng)

工程菌培養(yǎng)：類似于普通微生物的培養(yǎng)。另外要考慮：營養(yǎng)物質(zhì)的濃度有毒代謝物質(zhì)的排放導(dǎo)入基因的穩(wěn)定性基因的轉(zhuǎn)錄效率、翻譯產(chǎn)物向外分泌等因素。本文檔共120頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期一\17點46分1．培養(yǎng)裝置重組大腸桿菌——通氣攪拌罐實驗室中以基礎(chǔ)實驗設(shè)備進(jìn)行（一般采用通氣攪拌發(fā)酵罐，如：大腸桿菌）；但操作要謹(jǐn)慎，防止工程菌株的外漏和擴散；中試試驗必須要有良好的重復(fù)性，應(yīng)用全自動的控制系統(tǒng)，減少接觸，并且盡可能地獲得大量的發(fā)酵參數(shù)。工程菌的培養(yǎng)裝置既要防止外界微生物侵入罐內(nèi)，污染雜菌，又必須不使重組體外漏。這是與沿用的通氣攪拌式培養(yǎng)罐的區(qū)別所在。重組動物細(xì)胞——動物細(xì)胞培養(yǎng)裝置(安瓿瓶)本文檔共120頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期一\17點46分2．培養(yǎng)基和高密度發(fā)酵

工程菌發(fā)酵有兩條基本要求：使菌體生長良好，獲得高濃度菌體(即高密度發(fā)酵)，才能得到最多的產(chǎn)物。

一般的微生物發(fā)酵菌體干重：大腸桿菌125g/L；釀酒酵母145g/L?；蚬こ叹?，一般達(dá)到200g/L。其次，發(fā)酵用培養(yǎng)基盡可能的簡單，以便分離產(chǎn)物。使用合成培養(yǎng)基，包括葡萄糖、銨鹽和無機鹽等。使用盡可能廉價的維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型的工程菌。本文檔共120頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期一\17點46分3．菌株和質(zhì)粒的穩(wěn)定性

工程菌中的質(zhì)粒的穩(wěn)定性（傳代）和質(zhì)粒內(nèi)在的穩(wěn)定性很重要。質(zhì)粒保存率高，相應(yīng)地就會得到高濃度的產(chǎn)物?？衫觅|(zhì)粒帶氨芐青霉素等抗生素抗性標(biāo)記。目前多采用兩個以上的抗生素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒，帶有這種質(zhì)粒的菌株在藥物的存在下能夠生長，反之則菌株則不能夠生長。利用這種選擇性，還可以對工程菌遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。

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三、安全問題（一）重組DNA實驗準(zhǔn)則

準(zhǔn)則主內(nèi)容：物理密封（P1～P4）和生物學(xué)密封（B1和B2）物理密封：將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。（實驗設(shè)備、實驗室設(shè)計、試驗注意事項）生物學(xué)密封：用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主（如維生素或氨基酸營養(yǎng)缺陷型），同時用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴散。本文檔共120頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期一\17點46分重組菌株外漏的可能性主要有：機械密封；接種；排氣；取樣；放罐等。培養(yǎng)裝置能夠防止重組體外漏和雜菌的侵入，并且能夠密閉滅菌；尾氣排除要有除菌裝置，如果有氣溶膠產(chǎn)生必須要有收集氣溶膠的設(shè)備；發(fā)酵后的下游工作必須在密閉設(shè)備或者安全柜內(nèi)進(jìn)行。工業(yè)生產(chǎn)中重組菌培養(yǎng)的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)（LS1，LS2）本文檔共120頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期一\17點46分

(二)防止基因重組菌外漏的措施

培養(yǎng)工程菌的外界條件至少要遵守物理密封(P1～P4)方法中的P1級規(guī)定。從生物安全性來考慮，常采用維生素或氨基酸營養(yǎng)缺陷型的工程菌。生產(chǎn)中，以下部分和操作均應(yīng)采取一些措施，以防重組菌外漏：①排氣；②機械密封；③取樣；④培養(yǎng)后的滅菌；⑤接種；⑥放罐。

企業(yè)中進(jìn)行重組菌培養(yǎng)的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)有LS-1和LS-2。本文檔共120頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期一\17點46分1.概念第三節(jié)動植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)：將來自動物的某些器官或組織細(xì)胞，在模擬體內(nèi)生理條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)使之存活和生長。（1975年后進(jìn)入了新的階段：基因工程細(xì)胞猴腎細(xì)胞產(chǎn)生生長激素1mg/d）。目前的單細(xì)胞狀態(tài)培養(yǎng)早期的組織片培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期一\17點46分2.動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物類型目前利用動物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物有5大類：1）病毒疫苗。如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、乙型肝炎等疫苗。2）免疫調(diào)節(jié)劑。如干擾素、白細(xì)胞介素、胸腺素、轉(zhuǎn)移抑制因子等。3）激素。如絨毛促性腺素、生長激素、促紅細(xì)胞生成素等。4）人體活性蛋白。如胰島素、血纖維蛋白溶酶原。5）藥用酶。尿激酶、天門冬酰胺酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。本文檔共120頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期一\17點46分動物胚胎幼齡動物器官細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（1）原代（初代）培養(yǎng)細(xì)胞：動物組織經(jīng)過切碎、化學(xué)或酶處理得到的細(xì)胞，在培養(yǎng)期內(nèi)（50代左右）其生長性狀保持正常（一般20代左右的細(xì)胞可以作為種細(xì)胞凍存，生產(chǎn)疫苗、尿激酶和干擾素等）。3.動物細(xì)胞的性質(zhì)（2）確立細(xì)胞株：原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過反復(fù)分裂出現(xiàn)變異，能夠在體外培養(yǎng)時無限制性得增殖，其形態(tài)遺傳因子抗原性等都失去了原有的特性。本文檔共120頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期一\17點46分（3）移植繼代培養(yǎng)：用酶液處理的貼壁附著細(xì)胞可以分散為單層細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)又可形成貼壁細(xì)胞（細(xì)胞株）。成纖維細(xì)胞與確立細(xì)胞株繼代培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)過幾代反復(fù)分裂為成纖維細(xì)胞，大部分不具有癌化性，保留原代培養(yǎng)細(xì)胞的特性；到分裂至50代左右分裂停止，繼而死亡；此過程中少部分發(fā)生變異為確立細(xì)胞株。確立細(xì)胞株：有無限增殖的繁殖特性（遺傳物質(zhì)發(fā)生改變），大多數(shù)情況下可以進(jìn)行大量懸浮培養(yǎng)，但具有癌化性質(zhì)。本文檔共120頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期一\17點46分細(xì)胞來源：胚胎及成幼齡動物的組織器官單個細(xì)胞原代細(xì)胞細(xì)胞株細(xì)胞系剪碎胰蛋白酶分離細(xì)胞洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變遺傳物質(zhì)發(fā)生改變本文檔共120頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期一\17點46分動物細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期一\17點46分目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、cho（中華倉鼠卵巢）細(xì)胞、BHK-21(倉鼠腎細(xì)胞)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。本文檔共120頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期一\17點46分2.培養(yǎng)條件溫度為37℃±0.5℃

pH接近中性6.8-7.6，，多數(shù)細(xì)胞對偏酸性的環(huán)境有耐受力；培養(yǎng)體系調(diào)節(jié)酸堿性利用CO2(NaHCO3)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物組成的緩沖體系；氣體：氧，二氧化碳，氮氣；溶解氧的控制采用通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。目前常用的較多的是將硅氧管浸入培養(yǎng)液中，增加氣液接觸面。營養(yǎng)條件需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供。本文檔共120頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期一\17點46分1)實驗室儀器和設(shè)備：常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：如CO2孵箱；培養(yǎng)器材：如培養(yǎng)瓶，純水設(shè)備，干燥消毒除菌設(shè)備，清洗設(shè)備等。2)培養(yǎng)液：目前常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。本文檔共120頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期一\17點46分細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)機本文檔共120頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期一\17點46分3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實驗，如進(jìn)行藥物和受體及營養(yǎng)等方面的研究時，需要使用無血清培養(yǎng)基。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期一\17點46分4)平衡鹽溶液：主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素：常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期一\17點46分6)其它添加成分：緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES，緩沖效能(pKa)在20℃時為7.55，37℃為7.31；HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調(diào)整pH常常用NaHCO3溶液。有機補充物，如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等。促細(xì)胞分裂因子，如生長因子類的FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期一\17點46分3.動物細(xì)胞培養(yǎng)特性除單細(xì)胞原生動物外，細(xì)胞培養(yǎng)過程具有以下特性：①細(xì)胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需用抗生素；②動物細(xì)胞較微生物大得多．無細(xì)胞壁，機械強度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；③培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強力通風(fēng)與攪拌形成的較大流體剪切力；④在培養(yǎng)中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性；⑤產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，生產(chǎn)成本較高，但產(chǎn)品價格昂貴；⑥大規(guī)模培養(yǎng)時，不可照用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗；⑦原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。本文檔共120頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期一\17點46分4.動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法

依細(xì)胞種類：原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)依培養(yǎng)容器和方式：靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)中空纖維培養(yǎng)、固定床或流化床培養(yǎng)依培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)從生產(chǎn)實際分為：懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期一\17點46分4.動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法(1)貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。適用于一切貼壁依賴性細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細(xì)胞就開始有絲分裂并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長表面，形成致密的單層細(xì)胞。這種培養(yǎng)的方法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。接觸抑制：貼壁生長的細(xì)胞，當(dāng)每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時，細(xì)胞就停止增殖，長成單層的細(xì)胞。須在重新分散后，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，才能繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代。本文檔共120頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期一\17點46分幾個概念貼壁依賴性細(xì)胞：需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細(xì)胞。大多數(shù)動物細(xì)胞都屬于此類。非貼壁依賴性細(xì)胞：不依賴于固體支持物表面生長的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，被稱為懸浮細(xì)胞。舉例：血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞。兼性貼壁依賴性細(xì)胞：對支持物的依賴性不嚴(yán)格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、L929細(xì)胞。理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系本文檔共120頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期一\17點46分貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。

●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。

●適用于所有類型細(xì)胞。本文檔共120頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期一\17點46分貼壁培養(yǎng)的缺點：操作麻煩，傳代或擴大培養(yǎng)時需先消化，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長；

本文檔共120頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期一\17點46分細(xì)胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。

本文檔共120頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期一\17點46分轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞最初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器-轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。

優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等。

缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小，細(xì)胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。

本文檔共120頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期一\17點46分反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)：此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。本文檔共120頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期一\17點46分(2)懸浮培養(yǎng)讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。適用于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。由于動物細(xì)胞的特點，其培養(yǎng)方式在許多方面與經(jīng)典發(fā)酵不同。小規(guī)模：轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模：發(fā)酵罐式的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵是要選擇適當(dāng)?shù)臄嚢韬屯庋b置。懸浮培養(yǎng)，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，有成熟的理論計算，可以借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗，放大效應(yīng)小。但是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低，本文檔共120頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期一\17點46分優(yōu)點：操作簡便，培養(yǎng)條件比較單一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計和實際操作中可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗；可連續(xù)收集部分細(xì)胞進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害；細(xì)胞收率高，并可連續(xù)測定細(xì)胞濃度，還有可能實現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。缺點：細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度較低。轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險。本文檔共120頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期一\17點46分無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。本文檔共120頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期一\17點46分(3)微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體是直徑為60～250μm的微珠（如葡聚糖Cytodex1微載體）。動物細(xì)胞貼壁于微載體上生長，微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞在微載體表面逐漸生長成單層的培養(yǎng)方法，或稱微珠培養(yǎng)法。此方法把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點融匯在一起。制備微載體的材料主要有：

葡聚糖明膠玻璃纖維素等本文檔共120頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期一\17點46分1967年，VanWezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。微載體是直徑60-250μm的微珠。多用帶不同基團的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其帶有適當(dāng)電荷或介質(zhì)，以利于細(xì)胞的貼壁及生長。

例如：葡聚糖Cytodex1微載體大小60~87μm

，在培養(yǎng)液中膨脹160~230μm，每微克表面積0.6m2，相當(dāng)于7個標(biāo)準(zhǔn)的旋轉(zhuǎn)瓶。（β-干擾素）本文檔共120頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期一\17點46分理想微載體需具備的條件微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性；微載體的材料無毒性；微載體的材料是惰性材料；材料比重為1.030-1.045g/ml；粒徑60-250μm（溶脹后），大小均一；具有好的光學(xué)透明性；基質(zhì)的性質(zhì)是軟性的；可耐120℃高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌原料充分，制作簡便，價格低廉，可反復(fù)使用本文檔共120頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期一\17點46分與微載體結(jié)合的生物反應(yīng)器系統(tǒng)本文檔共120頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期一\17點46分優(yōu)點：1)表面積／體積比大；2)把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點；3)培養(yǎng)基利用率高；4)簡化了細(xì)胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，采樣重演性好；5)可用簡單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長情況；6)收獲過程不復(fù)雜；7)放大較容易；8)勞動強度??；9)培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。本文檔共120頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期一\17點46分(4)固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學(xué)方法將細(xì)胞固定在載體介質(zhì)上，然后進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。應(yīng)用：貼壁依賴性和非貼壁依賴性細(xì)胞。優(yōu)點：細(xì)胞密度高、抗剪切力和污染，生產(chǎn)首選方法：共價交聯(lián)：雙功能試劑處理，細(xì)胞之間交聯(lián)。吸附：物理吸附使細(xì)胞貼附在固體載體表面。包埋：細(xì)胞包埋在載體內(nèi)部。微囊法：親水半透膜把細(xì)胞包埋在微囊內(nèi)。本文檔共120頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期一\17點46分生物反應(yīng)器必備條件制造生物反應(yīng)器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細(xì)胞直接接觸的材料，對細(xì)胞必須是無毒性的生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能密封性能良好，可避免一切外來的不需要的微生物的污染對培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，能保持環(huán)境質(zhì)量的均一(1)動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型5.動物細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備與技術(shù)本文檔共120頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期一\17點46分可長期連續(xù)運轉(zhuǎn)容器加工制造時要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修設(shè)備成本盡可能低生物反應(yīng)器必備條件本文檔共120頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期一\17點46分按規(guī)模大小可分為：實驗室規(guī)模：＜20L，用于培養(yǎng)工藝的研究;中試規(guī)模：20~100L，提供一定量的產(chǎn)品，供純化、臨床前的各種檢測和臨床觀察，也包括進(jìn)一步的工藝優(yōu)化實驗;生產(chǎn)規(guī)模：＞100L，用于生產(chǎn)，提供產(chǎn)品。本文檔共120頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期一\17點46分?jǐn)嚢韫奘缴锓磻?yīng)器氣升式生物反應(yīng)器透析袋或膜式生物反應(yīng)器中空纖維生物反應(yīng)器固定床或流化床式生物反應(yīng)器類型：本文檔共120頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期一\17點46分機械攪拌式生物反應(yīng)器本文檔共120頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期一\17點46分罐培養(yǎng)的技術(shù)要點1、培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)系統(tǒng)：基本上與微生物相似，但有些特殊要求。①攪拌槳葉的形狀（海輪或傾斜葉片）和攪拌轉(zhuǎn)速（40－50rpm

）要有特殊設(shè)計。②培養(yǎng)系統(tǒng)必須保持長期無菌狀態(tài)（系統(tǒng)密封性；抗生素）。③培養(yǎng)罐、配管的材質(zhì)必須要對培養(yǎng)的細(xì)胞無毒害作用（通常采用不銹鋼）。2、培養(yǎng)條件的控制：可采用分批、流加、半連續(xù)和連續(xù)，微載體培養(yǎng)只能用分批培養(yǎng)法；培養(yǎng)溫度、溶解氧、pH、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速等也要控制，而且控制的精確度要更高。本文檔共120頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期一\17點46分氣升式生物反應(yīng)器本文檔共120頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期一\17點46分其中關(guān)鍵的是一個籠式撐拌器?；\式通氣裝置的特點主要是可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時，氣泡直接損傷細(xì)胞（因為氣泡已被上部的200目絲網(wǎng)機械地破壞了。氣腔式反應(yīng)器（懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用）本文檔共120頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期一\17點46分

與攪拌式生物反應(yīng)器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和營養(yǎng)的傳遞好，由于沒有了機械攪拌的結(jié)構(gòu)，有利于設(shè)備的密封，降低了造價。高徑比一般在10：1左右。本文檔共120頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期一\17點46分中空纖維反應(yīng)器本文檔共120頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期一\17點46分中空纖維反應(yīng)器：左右兩箭頭為無菌空氣進(jìn)出口。細(xì)胞生長在由半透性的多孔膜制成的中空纖維的外表面。中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)本文檔共120頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期一\17點46分由數(shù)百乃至數(shù)千根中空纖維集束組成的反應(yīng)器，纖維的材料為聚砜或丙烯共聚物，纖維壁厚為50-100m，呈多孔性，內(nèi)層為超濾膜，內(nèi)腔直徑為200m，兩端用環(huán)氧樹脂等材料將纖維粘和在一起，并使內(nèi)腔開口于外加的塑料圓筒，使形成兩個隔開的腔。①不能重復(fù)使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測。本文檔共120頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期一\17點46分在中空纖維生物反應(yīng)器中就形成了兩個空間：一是“內(nèi)室”，即纖維管內(nèi)空間，可灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長；二是“外室”，即纖維管與管之間的間隙；細(xì)胞接種到外室，細(xì)胞貼附在外室的管壁上，并迅速吸取從內(nèi)室滲透出來的養(yǎng)分，迅速生長繁殖。本文檔共120頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期一\17點46分膜式生物反應(yīng)器本文檔共120頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期一\17點46分在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如乳酸和氨等，對細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的產(chǎn)生會產(chǎn)生抑制作用，因此有些學(xué)者設(shè)計了透析袋或膜式反應(yīng)器，它們可將這些有害代謝產(chǎn)物透析或過濾掉，從而使細(xì)胞生長至更高密度，同時可根據(jù)需要選用不同相對分子質(zhì)量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內(nèi)或與細(xì)胞分離開。本文檔共120頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期一\17點46分結(jié)構(gòu)較簡單，裝填的材料可以是一切對細(xì)胞無毒、又有利于細(xì)胞貼附的材料，有實心載體和有孔載體兩類。本文檔共120頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期一\17點46分Wave搖袋式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器本文檔共120頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期一\17點46分（2）動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式分批式操作補料-分批（或流加式）操作（細(xì)菌生產(chǎn)中常用）半連續(xù)式操作連續(xù)式操作（個別情況下用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)）灌流式操作本文檔共120頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期一\17點46分灌流式操作定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。本文檔共120頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期一\17點46分細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，營養(yǎng)條件好，有害代謝廢物濃度低；可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間縮短，可及時收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。灌流式操作的優(yōu)點本文檔共120頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期一\17點46分動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等（3）大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)的問題及對策

①優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境②改變細(xì)胞特性③提高產(chǎn)品的產(chǎn)率本文檔共120頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期一\17點46分①細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。體外動物細(xì)胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細(xì)胞生長的主要因素之一。氨的積聚使細(xì)胞內(nèi)UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影響細(xì)胞的生長及蛋白的糖基化過程。本文檔共120頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期一\17點46分②細(xì)胞死亡與凋亡

最近研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中細(xì)胞的死亡中80%是凋亡所導(dǎo)致，而不是以前所認(rèn)為的壞死。而在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞高活性和高密度的最大障礙。細(xì)胞凋亡/死亡多是在營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時發(fā)生。因此，理論上講，防止或延長細(xì)胞死亡或使其處于一種“細(xì)胞靜止”過程可以有效降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生，有利于提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度、延長細(xì)胞的培養(yǎng)周期，從而提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量。本文檔共120頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期一\17點46分a）營養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡

在常規(guī)生物反應(yīng)器構(gòu)造中，營養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關(guān)鍵營養(yǎng)可抑制凋亡、延長培養(yǎng)時間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。本文檔共120頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期一\17點46分b）基因抗凋亡

與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對其進(jìn)行正、負(fù)向的調(diào)控，因此可通過導(dǎo)入相應(yīng)基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出很強的抗凋亡活性。此外，向CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）中導(dǎo)入p21、p27的基因，使細(xì)胞周期中G1期延長（細(xì)胞靜止），改造后，細(xì)胞活力正常，外源基因表達(dá)蛋白量提高。其優(yōu)點是產(chǎn)品成本降低，產(chǎn)量提高，遺傳一致性高。

本文檔共120頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期一\17點46分c）化學(xué)方法抗凋亡

凋亡發(fā)生時細(xì)胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的改變，有些變化如改變細(xì)胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應(yīng)階段，這在絕大多數(shù)細(xì)胞死亡中是相同的。因此，阻止這些生化物質(zhì)的改變可能阻止或至少延遲細(xì)胞凋亡的發(fā)生，運用化學(xué)物質(zhì)可抑制信號效應(yīng)階段的發(fā)生，被認(rèn)為是抗調(diào)亡策略之一。本文檔共120頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期一\17點46分③培養(yǎng)基與細(xì)胞系無血清培養(yǎng)基成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域研究的一大課題。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免了血清的批次、質(zhì)量、成分等對細(xì)胞培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。但無血清培養(yǎng)基并不適用于廣泛的細(xì)胞類型，不同類型的細(xì)胞甚至不同的細(xì)胞系或細(xì)胞株都有可能有各自的無血清培養(yǎng)基構(gòu)成。本文檔共120頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期一\17點46分④過程監(jiān)控大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)中由于大量細(xì)胞的代謝，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控更為重要。本文檔共120頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期一\17點46分第三節(jié)動植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)二、植物組織細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)：將植物的部分組織和器官切下，進(jìn)行表面消毒殺菌，在一定培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用于獲得種苗、新的組織和器官或者生產(chǎn)生物藥物。目前，組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)進(jìn)行的生產(chǎn)：珍惜植物愈傷組織幼苗；生物堿；皂甙；色素等等，植物的次級代謝物優(yōu)點：不受氣候影響；可以人工控制，目的產(chǎn)物的獲取有針對性；可以進(jìn)行定向的生物轉(zhuǎn)化植物組織培養(yǎng)主要用于珍惜植物種苗的繁殖和次生代謝產(chǎn)物的獲得。本文檔共120頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期一\17點46分①人為控制條件，克服人工栽培的不足；②不受季節(jié)氣候的影響，不需占用大量耕地；③可以排除病蟲害的侵?jǐn)_；④可以進(jìn)行特定的生物轉(zhuǎn)化，克服化學(xué)合成的缺點。用植物組織培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)優(yōu)點：本文檔共120頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期一\17點46分植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性：1.植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，有纖維素細(xì)胞壁。細(xì)胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2.培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；3.細(xì)胞生長的中期及對數(shù)期，易凝聚為直徑達(dá)0.4mm的團塊，懸浮培養(yǎng)較難；4.培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大，能耐受通風(fēng)攪拌；本文檔共120頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期一\17點46分植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性：5.具有群體效應(yīng)、無錨地依賴性及接觸抑制性；6.因為有細(xì)胞壁，培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量較低；7.細(xì)胞培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性，因而易分化，從而導(dǎo)致目的產(chǎn)物低于原植物體內(nèi)的濃度；8.懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細(xì)胞濃度，否則不生長（25000～50000個/mL）。

本文檔共120頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期一\17點46分植物細(xì)胞培養(yǎng)流程一般為：細(xì)胞株的建立：愈傷組織的培養(yǎng)，分離出單細(xì)胞的優(yōu)良無性繁殖體系經(jīng)搖瓶獲得種子，擴大種子培養(yǎng)放大培養(yǎng)本文檔共120頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期一\17點46分紫草寧細(xì)胞培養(yǎng)效果進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)，并將從愈傷組織中分離出單細(xì)胞，進(jìn)行優(yōu)良的細(xì)胞株選擇，建立無性繁殖細(xì)胞系，經(jīng)培養(yǎng)獲得的游離細(xì)胞擴大培養(yǎng)作為種子供大規(guī)模發(fā)酵使用。目前采用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行的植物次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，其產(chǎn)量都高于原來植物體中的代謝物含量，如：小檗堿，冬蟲夏草，紫草素等。本文檔共120頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期一\17點46分一般的植物細(xì)胞培養(yǎng)采用深層液體培養(yǎng)，營養(yǎng)成分除了碳氮源，無機鹽以外，還包括各種生長因子（維生素）和植物生長調(diào)節(jié)劑（隨生產(chǎn)產(chǎn)物的不同而改變）（煙草細(xì)胞培養(yǎng)基RM-1962）由于植物細(xì)胞的特殊性質(zhì)，振蕩或攪拌培養(yǎng)時需要控制特定的轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度：振蕩培養(yǎng)振蕩頻率100左右偏心距4cm左右；攪拌轉(zhuǎn)速100rpm以下；培養(yǎng)溫度都在30℃以下（對于愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)的溫度，應(yīng)視不同植物來源而不同）。培養(yǎng)條件本文檔共120頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期一\17點46分植物細(xì)胞培養(yǎng)需要解決的問題及基本方法問題包括：①氧和二氧化碳的控制，過多氧過少氧均不利于生長；②營養(yǎng)物的供應(yīng)，同動物細(xì)胞；③細(xì)胞密度過高引起細(xì)胞團聚甚至分化；④培養(yǎng)過程中細(xì)胞的分化的防止；⑤細(xì)胞取得中微生物的去除；⑥細(xì)胞壁脆性的存在要求培養(yǎng)體系剪切力要小。基本工藝同樣可分為：分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)（恒化培養(yǎng)）和固定化培養(yǎng)。培養(yǎng)反應(yīng)器可分為通氣攪拌式、鼓泡式、氣升式等。實驗室小規(guī)?？捎脫u瓶、平板、微室等。本文檔共120頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期一\17點46分工藝過程例本文檔共120頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期一\17點46分第四節(jié)固定化細(xì)胞發(fā)酵一、概述細(xì)胞固定化技術(shù)-----是酶固定化技術(shù)的延伸，固定化細(xì)胞可稱為第二代固定化酶。方法：吸附、交聯(lián)、共價結(jié)合、包埋固定化酶-----是被固定在某一有限空間內(nèi)不再能自由流動而仍有催化活性的酶。固定化酶優(yōu)點：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。固定化酶缺點：固定化過程中往往會引起酶的失活。本文檔共120頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期一\17點46分固定化細(xì)胞與固定化酶相比，具有以下優(yōu)點①可以免除酶的提取和精制；②固定化細(xì)胞系統(tǒng)對外界條件(如pH)變化的敏感性不強，故有利于控制反應(yīng)；③允許有高負(fù)荷的載體，而載有固定化酶的載體，由于蛋白-蛋白之間的相互作用，可使酶活下降；④如果反應(yīng)系統(tǒng)需要許多酶和輔因子再生，固定化細(xì)胞則更適合。

本文檔共120頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期一\17點46分固定化技術(shù)1.吸附法①物理吸附②離子吸附2.包埋法①格子型包埋②微膠囊型包埋3.通過雙功能試劑進(jìn)行共價交聯(lián)4.和水不溶性載體共價結(jié)合包埋法具有使用的普遍性，主要包埋劑有：海藻酸鈉－CaCl2，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，卡拉膠等；微膠囊法：采用半透膜包裹細(xì)胞。本文檔共120頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期一\17點46分包埋法：將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法。優(yōu)點：步驟簡單，條件溫和，負(fù)荷量大，細(xì)胞泄露少，抗機械剪切。本文檔共120頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期一\17點46分包埋法缺點：擴散限制，并非所有的細(xì)胞處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴性細(xì)胞的固定。常用的載體：瓊脂糖；海藻酸鈣凝膠本文檔共120頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期一\17點46分取0.6ｇ海藻酸鈉溶于25ml無菌水,加熱溶解后,冷卻，靜置1h消泡；取5ml菌懸液搖勻倒入，再加無菌水30ml使海藻酸鈉的最終濃度2%,將海藻酸鈉與5ml菌懸液混合勻；用5ml注射器滴入100ml4%CaCl2溶液中,交聯(lián)固定12h。濾出固定化顆粒用生理鹽水洗凈。海藻酸鈉包埋法本文檔共120頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期一\17點46分瓊脂凝膠包埋法稱取1.5ｇ瓊脂溶于25ml水中，加熱溶解后加無菌水至25ml混勻,冷卻到55℃,將5ml菌懸液搖勻倒入混合均勻,立即將瓊脂與聚磷菌的混合物倒入無菌培養(yǎng)皿中,過夜，然后切成3×3×3mm的小方塊，用生理鹽水洗凈。本文檔共120頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期一\17點46分微囊法：用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊內(nèi)，細(xì)胞不能溢出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜。囊內(nèi)是微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長好、密度高。本文檔共120頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期一\17點46分

微囊法在動物細(xì)胞微囊化的制備中，主要是應(yīng)用海藻酸—聚氨基酸的方法:動物細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中。海藻酸鈣不溶于水，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，使球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動物細(xì)胞得以懸浮在其中。海藻酸和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。本文檔共120頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期一\17點46分細(xì)胞懸浮液海藻酸鈉溶液海藻酸鈣凝膠動物細(xì)胞CaCl2溶液微囊發(fā)生器

聚賴氨酸檸檬酸納溶液

微囊(動物細(xì)胞)具膜微囊溶液動物細(xì)胞膜動物細(xì)胞微囊的制備過程示意圖本文檔共120頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期一\17點46分聚賴氨酸和殼聚糖聚賴氨酸：在以海藻酸鈉為基質(zhì)的微膠囊研究中幾乎都采用它制備囊膜，但是聚賴氨酸價格十分昂貴(300～400$/g)。殼聚糖(CS)：源于甲殼素，含大量伯氨基。能與海藻酸鈉等陰離子聚電解質(zhì)反應(yīng)成膜，可作為聚賴氨酸的替代物。本文檔共120頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期一\17點46分微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應(yīng)注意：

●溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理條件下操作；

●所用試劑和膜材料對細(xì)胞無毒害；

●膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過；

●膜應(yīng)有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

本文檔共120頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期一\17點46分使用固定化細(xì)胞發(fā)酵的優(yōu)點：①分批發(fā)酵可用固定化細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)來代替；②可以利用高密度的固定化細(xì)胞集合體進(jìn)行發(fā)酵，反應(yīng)效率大大提高；③可以人為地控制固定化細(xì)胞的生理狀態(tài)，因為許多代謝產(chǎn)物(或酶)僅僅在細(xì)胞的靜止期才能形成，所以有利于產(chǎn)物的形成。發(fā)酵液的體積也大大減小。本文檔共120頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期一\17點46分二、理想的固定化細(xì)胞制備方法的特點①能夠控制固定化細(xì)胞的大小和孔隙度；②固定化所使用的原料應(yīng)該便宜、易得，成本應(yīng)盡量低；③固定化方法簡便、易行，過程溫和，盡量少損傷細(xì)胞；④具有穩(wěn)定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在所使用的pH和溫度下，不會被破壞；⑤固定化細(xì)胞應(yīng)具有良好的機械穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性；⑥所用載體，對細(xì)胞應(yīng)該是惰性的，即不損傷細(xì)胞；⑦底物、產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物能夠自由擴散，降低產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物對細(xì)胞酶反應(yīng)的抑制；⑧單位體積的固定化細(xì)胞應(yīng)該擁有盡可能多的細(xì)胞，當(dāng)使用固定化活細(xì)胞時，更有此需要。

本文檔共120頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期一\17點46分固定化細(xì)胞有3種不同的生理狀態(tài)：①固定化后是死細(xì)胞，這種狀態(tài)只適用于一種酶催化的反應(yīng)；②固定化后的細(xì)胞生活力不確定，這種狀態(tài)通常用于一種酶或少數(shù)幾種酶所催化的反應(yīng)；③固定化后是活細(xì)胞，這種狀態(tài)適用于多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶的反應(yīng)。

本文檔共120頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期一\17點46分本文檔共120頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期一\17點46分三、固定化生物反應(yīng)器按其用途可分為三類：①生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)器，多用于死細(xì)胞或不再生長繁殖的細(xì)胞。不供氧，不排CO2；②產(chǎn)物的生成與細(xì)胞的生長無關(guān)的生物反應(yīng)器，適用于處在生長狀態(tài)的細(xì)胞，有利于細(xì)胞的生長和產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，需或不需供氧，但須供給維持細(xì)胞生理活動和合成產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物；③生產(chǎn)初級代謝產(chǎn)物的反應(yīng)器，必須符合細(xì)胞生長的需要并供給充足的營養(yǎng)物，良好通氣，并排出生成的CO2，須控制細(xì)胞的濃度，以便在恒定的條件下進(jìn)行操作。

本文檔共120頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期一\17點46分三、固定化生物反應(yīng)器現(xiàn)有的常用固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器有：連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、膜反應(yīng)器、轉(zhuǎn)盤式生物反應(yīng)器和其他類型反應(yīng)器等。本文檔共120頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期一\17點46分固定化細(xì)胞膜反應(yīng)器最常用的膜反應(yīng)器是中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器。在中空纖維反應(yīng)器中，細(xì)胞既可處于纖維管中，又可處于管外，螺線式卷繞膜反應(yīng)器實質(zhì)上是卷成圓筒形的平板反應(yīng)器。本文檔共120頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期一\17點46分固定化細(xì)胞膜反應(yīng)器本文檔共120頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期一\17點46分膜反應(yīng)器膜反應(yīng)器的優(yōu)點是可以重復(fù)使用。因此，盡管投資放大，重復(fù)使用使這種形式的固定化反應(yīng)器比較經(jīng)濟。本文檔共120頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期一\17點46分（1）

aa的生產(chǎn)：L－天冬氨酸（具有高活性酶的大腸肝菌）6.固定化細(xì)胞的應(yīng)用（2）抗生素的生產(chǎn)：6-氨基青霉烷酸（6－APA）青霉素?；副疚臋n共120頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期一\17點46分（3）活性蛋白藥物的生產(chǎn)：主要由動物固定化細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，包括單抗，干