第8章基因工程原理1

PrinciplesofGeneEngineering藍(lán)色玫瑰本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering2009年10月20日，日本三得利公司研發(fā)的轉(zhuǎn)基因藍(lán)玫瑰第2代產(chǎn)品問世。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering這種藍(lán)玫瑰是三得利公司耗資30億日元培育而成，他們1990年就開始開發(fā)藍(lán)玫瑰，從藍(lán)三葉草中提取藍(lán)色素基因，將基因轉(zhuǎn)入玫瑰花，培植出藍(lán)玫瑰。這株玫瑰的花瓣中所含的色素為藍(lán)色，純度接近100%。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering本章內(nèi)容1基因工程的歷史和發(fā)展2基因工程的基本內(nèi)容和技術(shù)3基因工程相關(guān)酶學(xué)4基因工程中的載體和宿主系統(tǒng)5目的基因的獲得和分離方法6外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞7重組體的鑒定和分析8外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)9外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)10蛋白質(zhì)工程11基因工程的應(yīng)用和展望本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering1基因工程的歷史和發(fā)展主要內(nèi)容基因工程的概念和特征自然界中的基因工程基因工程簡(jiǎn)史基因工程歷史上的大事轉(zhuǎn)基因的安全性本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering在體外將核酸分子插入載體（病毒、質(zhì)粒等）構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參到原來沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，并使之穩(wěn)定繁殖。什么叫基因工程本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering基因工程兩大特征a跨越物種障礙，創(chuàng)造出大自然中不存在的生物類型bDNA片段在寄主體內(nèi)能夠穩(wěn)定遺傳并大量擴(kuò)增.本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering遺傳工程（geneticengineering）基因操作（genemanipulation）基因克隆（genecloning）分子克?。╩olecularcloning）重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）…………與”基因工程”類似的表述方法本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering農(nóng)桿菌侵染植物本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering基因工程是一門綜合學(xué)科本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering最為關(guān)鍵的技術(shù)是核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)，它們被稱為“分子剪刀”和“分子膠水”。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering基因工程的開路先鋒們PaulBergStanleyN.CohenHerbertBoyer本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering2基因工程的基本內(nèi)容和技術(shù)2.1基因工程的基本內(nèi)容（1）目的基因的獲得（基因分離或合成）（2）重組分子的形成：將目的基因與能夠自我復(fù)制并具有選擇性標(biāo)記的載體分子相連接而成（3）把重組DNA分子引入到合適的受體（寄主）細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增（4）從繁殖的大量細(xì)胞群體中篩選鑒定出含有重組DNA分子的受體細(xì)胞的克?。?）從篩選的受體細(xì)胞克隆中提取出已擴(kuò)增的目的基因后，或再克隆到表達(dá)載體上導(dǎo)入新的寄主細(xì)胞，以便產(chǎn)生人們所需要的物質(zhì)；或者將已擴(kuò)增的基因做進(jìn)一步的分析研究之用。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering2.2基因工程的基本技術(shù)本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering基因工程的主要操作步驟目的基因的獲得基因與載體的連接重組子的轉(zhuǎn)化重組子的篩選鑒定產(chǎn)生新物質(zhì)其他研究本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering3基因工程相關(guān)酶學(xué)3.1核酸限制性內(nèi)切酶3.2DNA連接酶3.3反轉(zhuǎn)錄酶3.4其他酶本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering基因工程中常用的部分酶舉例本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering3.1核酸限制性內(nèi)切酶本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering核酸限制性內(nèi)切酶，又稱為“分子剪刀”1968年，大腸桿菌中第一種限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有幾百種內(nèi)切酶，其中應(yīng)用與基因工程的有幾十種之多。而且大部分酶的產(chǎn)生都是利用基因工程的方法。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering限制性內(nèi)切酶的種類和特點(diǎn)特性內(nèi)切酶I內(nèi)切酶II內(nèi)切酶III組成輔助因子切割特點(diǎn)在基因工程中作用3種亞基ATPMg2+S-腺苷甲硫氨酸非特異性隨機(jī)切割,識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)相差1kb沒有用處單亞基Mg2+特異性切割,識(shí)別位點(diǎn)就是切割位點(diǎn)或在附近十分有用2個(gè)亞基ATPMg2+S-腺苷甲硫氨酸比較特異性的切割,識(shí)別位點(diǎn)在切割位點(diǎn)上游24-26bp處用處不大限制性內(nèi)切酶II，簡(jiǎn)稱限制性內(nèi)切酶或內(nèi)切酶本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering限制性內(nèi)切酶性質(zhì)（1）識(shí)別位點(diǎn):長(zhǎng)度一般4-8bp，具有回文結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering識(shí)別位點(diǎn)一般具有回文結(jié)構(gòu)本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分（2）切割后形成的末端特點(diǎn)：本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分5‘端突出本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分3‘端突出本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分平端本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分形成的粘性末端易于再連接本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering（3）內(nèi)切酶的命名內(nèi)切酶的名字由3個(gè)字母組成，物種屬名的第一個(gè)大寫字母加上種名的前2個(gè)小寫字母；還可以加上菌株的第一個(gè)字母和大寫的羅馬字母等以示區(qū)別。如從流感嗜血桿菌d株中分離得到3個(gè)不同的限制酶，分別命名為HindI,HindII和HindIII等。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分Haemophilusinfluenzae

d

嗜血流感桿菌d株HindIII

HindIII注意前3個(gè)字母是斜體如從流感嗜血桿菌d株中分離得到3個(gè)不同的限制酶，分別命名為HindI,HindII和HindIII等。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分（4）同裂酶(isoschizomer):又叫“異源同工酶”，指來源不同，但識(shí)別序列一致，而切割的方式相同或不同的酶。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分（5）同尾酶（isocaudamer）：來源不同，識(shí)別的靶序列也不同，但是切割后產(chǎn)生的末端相同的酶。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分來源識(shí)別序列切割序列同裂酶（異源同工酶）不同相同相同或不同同尾酶不同不同相同同裂酶與同尾酶比較本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering3.2DNA連接酶1967年第一次從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)DNA連接酶(ligase)，后來從噬菌體等中也發(fā)現(xiàn)有連接酶存在。又被稱為“分子膠水”。連接機(jī)制：催化相鄰的3’-OH與5’-P之間形成磷酸二酯鍵。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering常用的DNA連接酶：大腸桿菌的ligase：只能連接粘性末段，不能連接平末段；T4ligase：可以連接粘性末段或平末段。在分子生物學(xué)中的應(yīng)用：用于DNA片段之間的連接。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering3.3反轉(zhuǎn)錄酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)（1）反轉(zhuǎn)錄酶的組成和性質(zhì)反轉(zhuǎn)錄酶是一類獨(dú)特的DNA聚合酶，以RNA為模板，指導(dǎo)DNA的合成。又稱為“依賴RNA的DNA聚合酶”。1970年由Temin等首先在鳥類致病的RNA病毒中發(fā)現(xiàn)。由一條多肽鏈組成，但有多種酶的活性。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering（2）反轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中最主要的用途就是將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering反轉(zhuǎn)錄酶催化從RNA合成cDNA本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering

3.4其他酶DNA聚合酶I,反轉(zhuǎn)錄酶T3,T7,SP6RNA聚合酶,TaqDNA聚合酶

聚合酶

末段轉(zhuǎn)移酶,T4多核苷酸激酶,堿性磷酸酶修飾酶綠豆核酸酶,核酸酶S1外切酶III,DNaseI,RNaseA,RNaseH核酸酶本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering4基因工程中的載體和宿主系統(tǒng)4.1基因工程中載體系統(tǒng)

載體的概念、特征、發(fā)展歷程和類型常用的載體類型及其特征4.2基因工程中的宿主系統(tǒng)本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering4.1基因工程中載體系統(tǒng)4.1.1什么叫載體(vector)載體就是來源于大腸桿菌或噬菌體等的DNA,可供外源DNA插入并將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的片段。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering由于單獨(dú)的外源DNA片段不能在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在,所以載體的作用就是使目的DNA能夠長(zhǎng)期在細(xì)胞中存在下去。這是因?yàn)檩d體是一個(gè)獨(dú)立于染色體外的,可以自主復(fù)制并遺傳的單元。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering4.1.2作為克隆載體的基本條件a有自主復(fù)制能力（即本身是一個(gè)復(fù)制子），或整合到基因組DNA中,但仍保持獨(dú)立。b有合適的可供外源基因插入的克隆位點(diǎn)(單克隆或多克隆位點(diǎn))，外源基因的插入不影響其自主復(fù)制能力。c具備選擇標(biāo)記，以便對(duì)重組子進(jìn)行篩選。這些標(biāo)記包括對(duì)抗生素的抗性、氨基酸的合成酶、噬菌斑形成、產(chǎn)生色素等。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineeringd除保留必要序列外，載體本身應(yīng)盡可能的小，便于導(dǎo)入細(xì)胞和在細(xì)胞內(nèi)生存繁殖?？梢詳y帶一定長(zhǎng)度的外源DNA片段并有較高的拷貝數(shù)。e使用安全?？陕≥d體只能生長(zhǎng)在有限的宿主細(xì)胞內(nèi)，在體內(nèi)不能進(jìn)行重組，細(xì)胞間不能發(fā)生轉(zhuǎn)移，不產(chǎn)生有害性狀，不能離開工程宿主自由擴(kuò)散。f其他特殊要求。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering4.1.3載體發(fā)展的歷程載體的構(gòu)建發(fā)展經(jīng)歷大約3個(gè)時(shí)期：（1）第一階段：主要依賴天然存在的質(zhì)粒。如Cohen最早使用的pSC101。后來對(duì)載體進(jìn)行了一系列的改造，如刪除非必需序列、引入標(biāo)志基因、減少酶切位點(diǎn)等。如pBR322就是經(jīng)過改造的質(zhì)粒，使用非常廣泛。經(jīng)過改造，質(zhì)粒在細(xì)菌體內(nèi)的拷貝數(shù)均達(dá)到幾十以上，甚至上百，上千。pBR322成為現(xiàn)今多種質(zhì)粒的來源。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering4.1.3載體發(fā)展的歷程（2）第二階段：20世紀(jì)70年代后期至80年代中期。構(gòu)建出了一大批相對(duì)分子量小、拷貝數(shù)多、有多種特殊性能的載體。以pUC系列載體著名，集中了當(dāng)時(shí)載體的諸多優(yōu)點(diǎn)。并在此基礎(chǔ)上發(fā)展出pUC載體系列，可以滿足多種需要。此外，用于酵母、昆蟲、高等動(dòng)植物基因工程的各種載體也得到了發(fā)展。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering第三階段：近期，主要是借助于一些輔助序列引進(jìn)一些新的功能，如在pUC18/19質(zhì)粒載體中插入絲狀噬菌體M13的基因間隔區(qū)，其中含有單鏈復(fù)制起點(diǎn)，在M13輔助噬菌體幫助下，可以產(chǎn)生單鏈DNA模板，這種載體稱為pUC118/119。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering4.1.4載體的類型載體的類型很多，不同的分類方法會(huì)有不同的結(jié)果。例如：可以根據(jù)DNA分子克隆的目的分為：克隆載體、穿梭載體、表達(dá)載體等；根據(jù)使用時(shí)載體的宿主細(xì)胞類型，也可以分為：原核細(xì)胞載體（大腸桿菌載體）、真核細(xì)胞（哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞等）載體等。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering克隆載體：是指以繁殖DNA片段為目的的載體用于外源基因的重組、克隆、復(fù)制和保存。一般分子量較小，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)較高，所以外源DNA片段可以通過克隆技術(shù)大量獲得。穿梭載體：是指那些即可以在原核細(xì)胞中又可以在真核細(xì)胞中繁殖的載體，因?yàn)檫@類載體含有兩種復(fù)制起點(diǎn)。表達(dá)載體：可以使克隆的外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering1質(zhì)粒載體（plasmid）質(zhì)粒是一種亞細(xì)胞的有機(jī)體,結(jié)構(gòu)比病毒還簡(jiǎn)單,沒有蛋白質(zhì)外殼,沒有細(xì)胞外的生命周期,只能在寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立的增殖,并隨著寄主細(xì)胞的分裂而被遺傳下去。自然界中,不論是真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞,不論是格蘭氏陽性還是格蘭氏陰性細(xì)菌,甚至是真菌的線粒體中也有質(zhì)粒的存在。(1)質(zhì)粒的一般生物學(xué)特征本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering大腸桿菌中的質(zhì)粒本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering大腸桿菌中的質(zhì)粒絕大部分的質(zhì)粒由DNA組成，是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈分子，質(zhì)粒大小從1kb到200kb不等。質(zhì)粒存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，獨(dú)立于染色體外并能自主復(fù)制（含有復(fù)制起始區(qū)），可以穩(wěn)定地游離于染色體之外，一定時(shí)候又可逆地整合到染色體上，或消失；質(zhì)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化從細(xì)菌外部進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部或在細(xì)菌之間迅速傳遞。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering質(zhì)粒的DNA雖然只占到染色體DNA的1-3%，但是卻編碼著一些非常重要的基因，賦予所在的寄主一些非染色體控制的性狀。包括抗性特征、代謝特性、修飾寄主生活方式等。質(zhì)粒還編碼產(chǎn)生抗菌素基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、產(chǎn)生腸毒素基因、重金屬抗性基因、產(chǎn)生細(xì)菌素的基因、誘發(fā)植物腫瘤基因、產(chǎn)生硫化氫基因等幾十種基因。這些基因常常賦予細(xì)菌一些非常特殊的本領(lǐng)。質(zhì)粒DNA編碼的表型本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineeringa共價(jià)閉合環(huán)形(cccDNA)：兩條DNA保持完整。一般成超螺旋狀態(tài)，稱為SC（supercoiled）構(gòu)型。b開環(huán)DNA(ocDNA)：兩條鏈中一條完整，另一條有一個(gè)或幾個(gè)缺口，稱為OC構(gòu)型。c線形分子(lDNA)：兩條鏈均斷裂，分子呈線形，稱為L(zhǎng)型。環(huán)形雙鏈DNA質(zhì)粒分子有3種構(gòu)型本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering結(jié)合型質(zhì)粒與非結(jié)合型質(zhì)粒：格蘭氏陰性細(xì)菌中的質(zhì)粒可以分為結(jié)合型質(zhì)粒與非結(jié)合型質(zhì)粒。其中，結(jié)合型質(zhì)粒攜帶除了自主復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有控制細(xì)菌結(jié)合和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的基因，所以又叫做“自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，可以在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，還可以帶動(dòng)宿主染色體的轉(zhuǎn)移。非結(jié)合型質(zhì)粒則與之相反。基因工程中采用的質(zhì)粒是屬于非結(jié)合型質(zhì)粒才能保證基因工程的安全。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering質(zhì)粒的拷貝數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下每條細(xì)菌染色體平均具有的質(zhì)粒DNA數(shù)目叫質(zhì)粒的拷貝數(shù)。嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的質(zhì)粒在每個(gè)寄主細(xì)胞中只有1-3個(gè)拷貝，屬于低拷貝質(zhì)粒；松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒在每個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)有10-60或幾百個(gè)拷貝的質(zhì)粒，屬于高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。質(zhì)粒的嚴(yán)謹(jǐn)型和松弛型不是固定的，寄主的種類會(huì)改變質(zhì)粒的類型。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering質(zhì)粒的不親和性(incompatibility)：也叫做質(zhì)粒的不相容性，指沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的質(zhì)粒不能在同一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定共存，其中有一個(gè)將被逐漸排斥(稀釋)掉，這樣的質(zhì)粒叫做不親和質(zhì)粒。由于質(zhì)粒具有不親和性，所以我們才能在只帶有一種質(zhì)粒的細(xì)菌中分離得到成分單一的質(zhì)粒DNA。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering基因工程中使用的質(zhì)粒載體天然質(zhì)粒不能完全符合載體的要求，基因工程中使用的質(zhì)粒載體都是經(jīng)過改造的。但不管怎樣，作為載體的質(zhì)粒都必須含有以下幾個(gè)元件：復(fù)制基因(確保插入的外源基因可以復(fù)制)選擇標(biāo)記(抗性標(biāo)記或生長(zhǎng)要求標(biāo)記)克隆位點(diǎn)(單克隆或多克隆位點(diǎn))本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineeringpBR3224361bppBR322質(zhì)粒是1977年Bolivar利用天然質(zhì)粒改造而來的。長(zhǎng)度為4361bppBR322特點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn):保證細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)維持在10-20個(gè)拷貝/細(xì)胞抗性基因2個(gè):抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因克隆位點(diǎn):單一的酶切位點(diǎn),供外源基因插入分子較小:有利于質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞中和方便DNA操作。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第60頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

便于獲得大量的克隆的基因產(chǎn)物,例如從ColE1和pMB1衍生而來的載體.低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

在一些情況下,當(dāng)想將外源基因產(chǎn)物的量控制在一定水平而避免對(duì)寄主細(xì)胞造成傷害.如pSC101,pLG338,pLG339,pHSG415等質(zhì)粒載體.本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第61頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第62頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第63頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering能夠使克隆在其中的外源基因在細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并翻譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體叫做表達(dá)載體。表達(dá)載體本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第64頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering表達(dá)載體必須具備的條件(1)有強(qiáng)的啟動(dòng)子,可以為宿主的RNA聚合酶識(shí)別.(2)有強(qiáng)的終止作用;(3)受控的啟動(dòng)子(可誘導(dǎo)型等).(4)起始密碼子ATG與SD序列的距離要適當(dāng),便于翻譯.(5)具有復(fù)制起點(diǎn);(6)具有多克隆位點(diǎn),便于外源基因插入,具有選擇性標(biāo)記等。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第65頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering表達(dá)載體要件本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第66頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering2噬菌體載體（phagevector）λ噬菌體是一種目前研究最為透徹的大腸桿菌的雙鏈DNA噬菌體，大小為50kb左右，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中有1/3左右的DNA序列不是病毒繁殖所必須的,這一段DNA序列可以用其他DNA序列取代，經(jīng)過點(diǎn)突變、基因組置換等改造，而發(fā)展成λ噬菌體載體。λ噬菌體載體本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第67頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering特點(diǎn)：(1)可以容納比質(zhì)粒更大的外源DNA，理論上可以克隆的外源基因大小為23kb（實(shí)際只有15kb左右）；(2)噬菌體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的效率比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第68頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering單鏈DNA噬菌體載體親源關(guān)系很近的大腸桿菌噬菌體M13、f1和fd都含有單鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度是6400bp。M13進(jìn)入細(xì)菌后，其中的單鏈DNA起模板作用，形成雙鏈的復(fù)制型DNA（RFDNA）。不引起宿主菌的裂解。宿主菌通過一種非溶菌的方式將噬菌體擠出去，每個(gè)細(xì)胞每個(gè)世代可以釋放大約1000個(gè)左右的子代噬菌體。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第69頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering將M13噬菌體的雙鏈的復(fù)制型DNA（RFDNA）改造，可以形成單鏈DNA噬菌體載體?？梢匀菁{外源基因大小在1500bp左右。由于這種M13噬菌體可以生產(chǎn)單鏈DNA，所以M13載體在基因工程中用于單鏈探針的制備、DNA的單鏈測(cè)序和定位誘變等。近年來發(fā)展起來的噬菌體表面展示技術(shù)主要使用的就是M13噬菌體載體。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第70頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering噬菌粒載體由單鏈?zhǔn)删w載體和質(zhì)粒載體結(jié)合而成的新型載體,叫做噬菌粒(phagemidorphasmid)。可以產(chǎn)生單鏈DNA也可以產(chǎn)生雙鏈DNA，載體分子量小，克隆能力大，使用非常廣泛。如pUC118和pUC119噬菌粒載體(pUC+M13).pBluescript噬菌粒載體(又叫做pKS/pSK),可以用做體外轉(zhuǎn)錄載體使用，用途也十分的廣泛，幾乎世界上每一個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都在使用。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第71頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering3酵母載體酵母是基因工程中使用非常廣泛的真核單細(xì)胞生物，其中使用的載體一般可以分為三類：3.1質(zhì)粒載體3.2整合載體3.3酵母人工染色體本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第72頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineeringa酵母附加型質(zhì)粒載體（YEP）：來源于野生質(zhì)粒，大小6300bp，長(zhǎng)度約為2μm，又叫做2μm質(zhì)粒。是雙鏈環(huán)狀DNA，有一段長(zhǎng)度為599bp的反向重復(fù)序列而分為兩個(gè)部分，各有基因的啟動(dòng)子和控制元件。YEP是在2μm質(zhì)?；A(chǔ)上加上酵母核DNA和細(xì)菌質(zhì)粒pMB9部分序列改造而成的。3.1質(zhì)粒載體本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第73頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineeringc酵母著絲粒質(zhì)粒（YCP）：為了克服酵母復(fù)制質(zhì)粒YRP傳代不穩(wěn)定的缺點(diǎn)而構(gòu)建了YCP質(zhì)粒。但是這種質(zhì)粒對(duì)宿主有毒性，只能以低拷貝數(shù)存在。b酵母復(fù)制質(zhì)粒（YRP）：由大腸桿菌質(zhì)粒pBR322加上酵母染色體的自主復(fù)制序列而成，高拷貝，不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率高，但是多代培養(yǎng)后，拷貝數(shù)減少。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第74頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering3.2整合載體整合載體（intergratingvector,YIP）是指不含有酵母的自主復(fù)制序列，不能在酵母中獨(dú)立復(fù)制，必須在載體整合到酵母染色體上之后才能使其中的基因得到表達(dá)。3.3酵母人工染色體利用酵母載體產(chǎn)生的酵母人工染色體克隆系統(tǒng)可以克隆非常大的DNA片段，從而代替噬菌體載體合cos質(zhì)粒載體，克隆外源DNA的能力可以達(dá)到1000-2000kb（1-2Mb），詳見下文。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第75頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering4植物基因克隆載體目前用于植物基因轉(zhuǎn)移中所用的載體主要是植物病毒和其他一些病原體，還有一些細(xì)菌攜帶的特殊質(zhì)粒。植物基因轉(zhuǎn)移的病毒載體單鏈RNA植物病毒（如煙草脆裂病毒TRV，雀麥草花葉病毒BMV）單鏈DNA植物病毒（如番茄金色花葉病毒TGMV）雙鏈DNA植物病毒（如花椰菜花葉病毒CaMV），使用較多植物基因工程的質(zhì)粒載體來自土壤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒，可以將外源基因轉(zhuǎn)入單子葉和雙子葉植物中。本文檔共83頁(yè)；當(dāng)前第76頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)47分PrinciplesofGeneEngineering5動(dòng)物基因克隆載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒載體人工構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體應(yīng)該具備的條件是：（1）含有大腸桿菌復(fù)制子和抗性標(biāo)記；同時(shí)含有真核細(xì)胞選擇標(biāo)記；（2）含