網(wǎng)織紅細胞檢測進展及其臨床應用

概述網(wǎng)織紅細胞(reticulocyte，Ret)是介于晚幼紅細胞和成熟紅細胞之間的過渡階段細胞，略大于成熟紅細胞。網(wǎng)織紅細胞是有核紅細胞剛剛失去核的階段，仍屬未完全成熟的紅細胞，漿內尚殘留有嗜堿性RNA，經(jīng)堿性染料（如天青B、煌焦油藍或新亞甲藍）活體染色后，在包體內可見藍色點狀或網(wǎng)狀結構，故名網(wǎng)織紅細胞。本文檔共28頁；當前第1頁；編輯于星期二\5點48分概述紅細胞在骨髓中生成，至發(fā)育為成熟紅細胞，經(jīng)歷了不同階段：干細胞、原始紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞、網(wǎng)織紅細胞，最后發(fā)育為成熟紅細胞。隨著細胞的成熟，RNA含量逐漸減低，至細胞完全成熟后消失或接近消失，即紅細胞中網(wǎng)線狀結構越多，表示細胞越幼稚。ICSH將Ret分為4型：Ⅰ型（絲球型）、Ⅱ型（花冠型或網(wǎng)型）、Ⅲ型（破網(wǎng)型）、Ⅳ型（顆粒型）。正常生理狀態(tài)下，Ⅰ型只存在于骨髓，Ⅱ型在外周血也很難見到，Ⅲ型僅有少量釋放到外周血，因此外周血網(wǎng)織紅細胞計數(shù)時以Ⅳ型為主。本文檔共28頁；當前第2頁；編輯于星期二\5點48分概述本文檔共28頁；當前第3頁；編輯于星期二\5點48分概述Ret是紅細胞成熟過程中的一個重要階段，是判斷骨髓紅系造血情況和療效觀察的重要指標。其檢測方法既有傳統(tǒng)的顯微鏡目測法，又有現(xiàn)代化的儀器計數(shù)法(如流式細胞儀、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)儀及血細胞分析儀)。本文檔共28頁；當前第4頁；編輯于星期二\5點48分

網(wǎng)織紅細胞檢測進展1.手工法2.血細胞分析儀法3.流式細胞儀法和專用網(wǎng)織紅細胞分析儀本文檔共28頁；當前第5頁；編輯于星期二\5點48分1.手工法手工法分玻片法和試管法。由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸發(fā)，染色時間偏短，因此結果偏低；試管法容易掌握，重復性較好，必要時還可以從混合血液中再取標本重新涂片復查。試管法被列為手工法Ret計數(shù)的參考方法。按衛(wèi)生部《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第2版，采用試管法用煌焦油藍染液對血液標本進行紅細胞活體染色、制片，選擇細胞分布較均勻、厚薄適中的體尾交界處，每份標本油鏡下參照陳寶梁的建議，即Ret>6%，計數(shù)紅細胞1000個；3%～5%計數(shù)紅細胞2000個；1%～2%應計數(shù)紅細胞4000個；小于1%計數(shù)紅細胞10000個。本文檔共28頁；當前第6頁；編輯于星期二\5點48分1.手工法傳統(tǒng)的顯微鏡計數(shù)方法操作較繁瑣、影響結果的因素較多。近年來，國內開始使用國際血液學標準化委員會(ICSH)推薦的Miller窺盤進行計數(shù)，規(guī)范了計算區(qū)域，減少了實驗誤差，使結果準確性有所提高(衛(wèi)生部臨檢中心建議，CV控制在15%之內)。Miller窺盤法是將一種光學圓片狀Miller窺盤安放在顯微鏡目鏡中，窺盤中有面積比例為1：9的2個正方形計數(shù)方格，只需計數(shù)1／9小方格內的紅細胞即可準確估量出整個大方格內的紅細胞數(shù)量。本文檔共28頁；當前第7頁；編輯于星期二\5點48分衛(wèi)生部臨床檢驗中心控制Ret計數(shù)CV≤15%需鏡檢的RBC數(shù)目Ret(%)計數(shù)Miller窺盤小方格RBC相當于縮視野法計數(shù)RBC數(shù)目1-244440003-52222000>61111000本文檔共28頁；當前第8頁；編輯于星期二\5點48分1.手工法國內很多學者在此基礎上設計了幾種改良的Ret計數(shù)窺盤。張時民等設計了一種雙環(huán)式結構的Ret計數(shù)窺盤，該盤的特點是小圓環(huán)和大圓環(huán)面積之比為1：10，小圓環(huán)為計數(shù)紅細胞數(shù)量，大圓環(huán)為計數(shù)Ret數(shù)量。其圓形結構更加適合于人們觀察和計數(shù)顯微鏡下細胞數(shù)量的習慣，而且此比例更加易于計算紅細胞和Ret的比值。本文檔共28頁；當前第9頁；編輯于星期二\5點48分1.手工法陳高遠則在這兩種窺盤的基礎上設計了改良式Miller窺盤，采用雙正方形結構，小方格和大方格之比也達到1：10，只是將紅細胞計數(shù)區(qū)域位移至中心部位，以方便紅細胞數(shù)量的計數(shù)。本文檔共28頁；當前第10頁；編輯于星期二\5點48分1.手工法劉志賢設計了一種新的Ret計數(shù)窺盤即180×4扇形Ret計數(shù)窺盤：圓形直徑為19mm，圓心角∠AOB=∠COD=∠EOF=∠GOH=180?；B=CD=EF=GH=180。計算公式為：Ret%=整個計數(shù)區(qū)域內的Ret數(shù)／(4個小扇面區(qū)域內的RBC總數(shù)×5)×100％。這種新型Ret計數(shù)窺盤4個扇形區(qū)域均勻分布在整個視野的4個方向，4個扇形面積之和是整個圓形面積的1／5，因此在理論上基本解決了紅細胞分布不均勻引起的問題，降低了系統(tǒng)誤差和隨機誤差。本文檔共28頁；當前第11頁；編輯于星期二\5點48分

手工法網(wǎng)織紅細胞活體染色染料評價染料評價新亞甲藍WHO推薦使用，對RNA著色強，試劑穩(wěn)定，Hb幾乎不著色煌焦油藍溶解度低，染料沉渣易附著紅細胞表面，影響辨認；易受變性珠蛋白小體、HbH包涵體干擾中性紅染液濃度低、背景清晰、網(wǎng)織顆粒與紅細胞對比鮮明；不受變性珠蛋白小體、HbH包涵體干擾本文檔共28頁；當前第12頁；編輯于星期二\5點48分

2.血細胞分析儀法1993年以來，可進行Ret計數(shù)的血細胞分析儀相繼問世，因其具有重復性好、準確度高、省時等優(yōu)點，正被越來越多的醫(yī)院所采用。儀器法Ret計數(shù)使用各種熒光染料和非熒光染料對Ret進行染色，采用鞘流技術和射頻技術等不同原理進行檢測。血細胞計數(shù)儀不僅可以計數(shù)Ret，同時還能檢測出網(wǎng)織紅細胞絕對值Ret#、網(wǎng)織紅細胞平均體積(MRV)、網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)(RMI)等許多參數(shù)，這些參數(shù)是Ret分析、臨床應用和研究的熱門領域。本文檔共28頁；當前第13頁；編輯于星期二\5點48分

2.血細胞分析儀法統(tǒng)計表明，儀器法測定Ret精密度有明顯提高：對低Ret標本，CV值在10%～21%之間；對正常范圍的標本，CV值在3%～16%之間；高值標本，CV值在2%～10%之間。本文檔共28頁；當前第14頁；編輯于星期二\5點48分

2.血細胞分析儀法雖然儀器法Ret計數(shù)有諸多優(yōu)點，而且精密度明顯優(yōu)于手工法，但也存在一些不足：第一，所有儀器分析的基本原理都是檢測Ret內RNA的存在量來決定其百分率和絕對值，當某些患者血液中有核細胞或淋巴細胞異常增加時，可導致Ret計數(shù)結果的假性增加；第二，冷凝集素存在、紅細胞的聚集、某些病理因素或藥物都能使紅細胞產(chǎn)生自身熒光；第三，自動化分析儀結果的準確性除了依賴于儀器本身的良好性能外，還應有良好的質控物隨時檢測儀器的狀態(tài)。另外，儀器成本高、價格貴，基層醫(yī)療單位投入較為困難。本文檔共28頁；當前第15頁；編輯于星期二\5點48分

3.流式細胞儀法和專用

網(wǎng)織紅細胞分析儀流式細胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)是一種多用途的精密分析儀器，應用派若寧、吖啶橙、噻唑橙等這些特殊的熒光染料與Ret中的RNA結合，當FCM發(fā)出的激光照射于細胞上時，根據(jù)細胞能否發(fā)射出特定顏色的熒光，通過單參數(shù)定量測定RNA，從而精確測定Ret占成熟紅細胞的比率。還可根據(jù)激光照射后發(fā)射出的熒光強度，或光吸收量大小、光散射量多少等參數(shù)的比例關系對Ret成熟程度進行分群，將其劃分為低熒光強度網(wǎng)織紅細胞(LFR)、中熒光強度網(wǎng)織紅細胞(MFR)、高熒光強度網(wǎng)織紅細胞(HFR)。本文檔共28頁；當前第16頁；編輯于星期二\5點48分

3.流式細胞儀法和專

用網(wǎng)織紅細胞分析儀FCM測定精密度明顯高于手工法3～6倍，可在數(shù)秒中檢20000個以上的紅細胞，如Ret在1.7％～6.6%，其平均CV值在4.3%。不足之處，流式細胞儀計數(shù)Ret受HOWELL－Jolly小體、瘧原蟲和血小板等干擾。本文檔共28頁；當前第17頁；編輯于星期二\5點48分網(wǎng)織紅細胞計數(shù)方法學評價檢測方法評價普通顯微鏡法簡便、成本低，可直觀細胞形態(tài)；影響因素多，重復性差玻片法水分易蒸發(fā)，染色時間短，結果偏低試管法易掌握，重復性較好，易復查Miller窺盤計數(shù)法規(guī)范計算區(qū)域，減少了實驗誤差，ICSH推薦方法儀器法檢測細胞多，精密度高，與手工法相關性好，易標準化。儀器貴；受H-J小體、有核紅細胞、血小板等干擾本文檔共28頁；當前第18頁；編輯于星期二\5點48分網(wǎng)織紅細胞檢測的臨床應用Ret計數(shù)及其各種參數(shù)(IRF、RMI、MRV、RPI等)在貧血的診治、骨髓移植、腫瘤的放化療和藥物療效檢測等方面具有重要參考價值。本文檔共28頁；當前第19頁；編輯于星期二\5點48分

1．網(wǎng)織紅細胞計數(shù)的應用貧血的恢復是通過骨髓釋放紅細胞生成素(EPO)完成的，Ret增加可被看成是骨髓造血功能對貧血的正常反應。失血性貧血時患者Ret各項指標會顯著增高，失血5～10d內Ret可達高峰，出血停止后2周可恢復正常，臨床上可應用此參數(shù)和特點來判別出血是否停止；缺鐵性貧血、巨幼細胞性貧血時也可見患者Ret輕度增加。Ret降低主要和造血功能減低有關，典型病例為原發(fā)性再生障礙性貧血、溶血性再生障礙性危象；此外還有急性白血病、繼發(fā)性再生障礙性貧血、化療和放療引起的骨髓造血功能抑制或減退等。本文檔共28頁；當前第20頁；編輯于星期二\5點48分

2．網(wǎng)織紅細胞生成指數(shù)(RPI)的應用RPI代表網(wǎng)織紅細胞的生成相當于正常人的多少倍。不同生理、病理情況下，Ret從骨髓釋放人外周血所需時間不同，故Ret計數(shù)值不能確切反映骨髓紅細胞系統(tǒng)造血功能，還應考慮Ret生存期限。通常Ret生存期限約為2d，若未成熟網(wǎng)織紅細胞提前釋放入血，Ret生存期限將延長，為了糾正網(wǎng)織紅細胞提前釋放引起的偏差，用RPI來反映Ret生成速率。本文檔共28頁；當前第21頁；編輯于星期二\5點48分

2．網(wǎng)織紅細胞生成指數(shù)(RPI)的應用RPI=RET%×被測HCT/正常人HCT×1/RET成熟天數(shù)。釋放入外周血的網(wǎng)織紅細胞越趨于幼稚，其成熟時間越長。由于網(wǎng)織紅細胞體積大于成熟紅細胞，大量網(wǎng)織紅細胞的提前釋放在某種程度上影響血細胞比容的測定結果。經(jīng)觀察，網(wǎng)織紅細胞成熟時間與Hct存在下列關系

HCT0.39-0.450.34-0.380.24-0.330.15-0.23﹤0.15Ret成熟時間(d)11.52.02.53.0本文檔共28頁；當前第22頁；編輯于星期二\5點48分

2．網(wǎng)織紅細胞生成指數(shù)(RPI)的應用RPI在估計紅細胞生成有效性和貧血起因的分類方法中起到重要作用。Kinetic等應用RPI較為準確地表達出Ret的成熟狀態(tài)，從而對貧血的類型進行劃分，如健康者平均RPI為1，當RPI≥3時表示紅細胞生成增加，如溶血性貧血和治療后的營養(yǎng)性貧血；而RPI≤2時為紅細胞生成減少，如缺鐵性貧血；對于EPO缺乏、無效造血等情況時，RPI多在2～3之間，Kinetic法則還無法確定。本文檔共28頁；當前第23頁；編輯于星期二\5點48分

3．網(wǎng)織紅細胞成熟度(IRF)的應用

IRF為不成熟的Ret與總Ret的比值，健康者平均值為0.22，參考范圍0.1～0.38，IRF越大表示不成熟的Ret的數(shù)量越多。這種幼稚Ret水平的改變一般比患者HGB、血小板、白細胞和臨床癥狀的變化出現(xiàn)更早。IRF和HFR的增高在很多白血病患者化療中是與粒細胞反應一致的指標和骨髓移植后恢復的第一信號。IRF與Ret#和RPI呈一弱的、顯著的正相關：IRF增加(≥0.23)，一般伴有Ret#增加，提示患者對于貧血有足夠的紅系反應；若IRF＜0.23，且RPI≤2，則說明紅系造血活性下降，則以慢性腎功能不全居多；Ret#正?；蚵缘停琑PI≤2，但IRF≥0.23，見于急性感染、鐮狀細胞性貧血危象、妊娠和MDS等狀況。IRF是評價貧血紅系增生活性的一項新的有用的指標，IRF結合Ret#和RPI可以為進一步闡明貧血分類提供有價值的信息。本文檔共28頁；當前第24頁；編輯于星期二\5點48分

4．網(wǎng)織紅細胞成熟指數(shù)(RMI)的應用該參數(shù)是計算參數(shù)，可由儀器自動計算，也可將儀器測定的Ret分群參數(shù)經(jīng)過人工計算得到。計算公式為：RMI=(MFR+HFR)／LFR×100%。文獻報道RMI的參考范圍，男性：17%～37%，女性：16%～35%。據(jù)報道，急性白血病化療后Ret#正常而RMI較高，化療中則Ret#和RMI都低；出現(xiàn)溶血危象時Ret#和RMI都高；ITP則Ret#正常而RMI較高。本文檔共28頁；當前第25頁；編輯于星期二\5點48分

5．網(wǎng)織紅細胞分群的應用⑴LF