第章RNA的生物合成

以DNA為模板合成RNA稱轉(zhuǎn)錄(transcription)。

大多數(shù)RNA分子，包括mRNA，rRNA，tRNA以及各種有特殊功能的小RNA，都是在RNA聚合酶的作用下，以4種核苷三磷酸為原料，以DNA為模板，按照堿基配對規(guī)律合成的.

一些RNA病毒可以在RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶或稱RNA復(fù)制酶作用下以RNA為模板合成RNA。

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1.轉(zhuǎn)錄的選擇性（編碼區(qū)、個別基因）,在時間和空間上的嚴(yán)格調(diào)控（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）。

復(fù)制:忠實,全部

RNA轉(zhuǎn)錄的一般特點本文檔共46頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\15點37分RNA轉(zhuǎn)錄的一般特點2.起始點、終止點（轉(zhuǎn)錄單位，是一個或多個基因）轉(zhuǎn)錄的起始由啟動子(promotor)控制。3.RNA聚合酶：負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶不需要引物，可以在稱作啟動子的特定起始位點從頭合成RNA。RNA聚合酶無校正功能。本文檔共46頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\15點37分4.轉(zhuǎn)錄方向：

從細(xì)菌到人類，RNA聚合酶本質(zhì)上均催化同一種反應(yīng)，即在一定的模板(DNA或RNA)指導(dǎo)下，以4種核苷三磷酸為原料，按堿基配對規(guī)律，從5'→3'合成RNA鏈。 5.模板鏈，非模板鏈

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基因轉(zhuǎn)錄時，兩條互補(bǔ)的DNA鏈有一條作為RNA合成的模板，稱作模板鏈(templatestrand)、負(fù)鏈(negativestrand)或反義鏈(anti-sensestrand)，

另一條鏈稱作非模板鏈(nontemplatestrand)、正鏈(positivestrand)或有義鏈(sensestrand)。非模板鏈也被稱作編碼鏈(codingstrand)。本文檔共46頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\15點37分 RNA聚合酶與啟動子結(jié)合后，一小段雙螺旋會解開，形成一個轉(zhuǎn)錄泡(transcriptionbabble)。轉(zhuǎn)錄過程中新生的RNA鏈與DNA模板形成一小段RNA-DNA雙螺旋(在E.coli中為8bp)，隨著新鏈的延伸，RNA鏈逐漸從模板剝離。同時轉(zhuǎn)錄泡不斷向前移動，其前方的雙螺旋在不斷解開，其后方又有雙螺旋逐漸形成,該過程由拓?fù)洚悩?gòu)酶催化(圖7-1)。本文檔共46頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\15點37分本文檔共46頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\15點37分

一個DNA分子含有若干個基因時，任一條鏈上都含有一些基因的編碼鏈和另一些基因的模板鏈.本文檔共46頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\15點37分

1963年J.Marmur和DotySpiegelnan用密度梯度離心將枯草桿菌的SP8噬菌體DNA雙鏈分為“輕鏈”、“重鏈”，發(fā)現(xiàn)只有一條鏈可與RNA雜交。現(xiàn)在將作為轉(zhuǎn)錄模板的DNA單鏈稱為模板鏈或反義鏈（antisenstrand），非模板鏈稱為有義鏈（sensestrand）或編碼鏈。在體外DNA的兩條鏈都可作為RNA合成的模板。本文檔共46頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\15點37分本文檔共46頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\15點37分7.2原核生物的轉(zhuǎn)錄7.2.1原核生物的RNA聚合酶

催化轉(zhuǎn)錄的酶稱RNA聚合酶(RNApolymerase,RNApol)，或DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶(DNA-directedRNApolymerase)。

原核生物只有一種RNA聚合酶，催化合成mRNA，rRNA和tRNA。

RNA合成速率:40nt/s的速度從5'→3'合成RNA。一個E.coli約含7000個RNA聚合酶分子，大約2000～5000個聚合酶同時催化RNA的合成。本文檔共46頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\15點37分1960年Weiss等發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶（RNAPol），其特點是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTP）為底物；（2）以DNA為模板；（3）按5'→3'合成RNA；（4）無需引物的存在能單獨起始鏈的合成；（5）第一個引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在體內(nèi)DNA雙鏈中僅一條鏈作為模板；（7）RNA的序列和模板是互補(bǔ)的。本文檔共46頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\15點37分

怎樣用實驗證實mRNA的合成總是延著5'→3'方向進(jìn)行的？

E.coli在0C時需13秒鐘才能加上一個核苷酸，但在37C每秒就可加上40個核苷酸。利用這個差別以14C來標(biāo)記U，在0C培養(yǎng)E.coli，提取這種正在伸長的mRNA分子，發(fā)現(xiàn)14C標(biāo)記首先出現(xiàn)在伸長的3'端，因此可以證明合成是延著5'→3'方向進(jìn)行的。本文檔共46頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\15點37分

全酶(holoenzyme)亞基組成為α2ββ‘σ。σ因子易于從全酶上解離，其他的亞基則比較牢固地結(jié)合成為核心酶(coreenzyme)。當(dāng)σ因子與核心酶結(jié)合成全酶時，即能起始轉(zhuǎn)錄，當(dāng)σ因子從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中釋放后，核心酶沿DNA模板移動并延伸RNA鏈。 σ因子的主要作用是特異性地識別轉(zhuǎn)錄的起始位點啟動子。

本文檔共46頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\15點37分螃蟹的大鉗熱水生菌(Thermusaquaticus,Taq)RNApol晶體結(jié)構(gòu)的帶狀圖解，b為其空間結(jié)構(gòu)的示意圖。本文檔共46頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\15點37分本文檔共46頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\15點37分盡管RNApol與DNApol都是以DNA為模板，從5‘→3’方向催化多聚核苷酸的合成，二者有明顯的差別：①RNApol只有5'→3'的聚合酶活性，沒有5'→3'外切酶和3'→5'外切酶的活性，缺乏自我校對的能力，錯配率較高，且聚合反應(yīng)的速度低，平均速率只有50nt/秒。②細(xì)菌的RNApol具有解鏈酶的活性，本身能夠促進(jìn)DNA雙鏈解鏈。③RNApol能直接催化RNA的從頭合成，不需要引物。本文檔共46頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\15點37分④RNApol的底物是核苷三磷酸，而不是脫氧核苷三磷酸。⑤RNApol催化產(chǎn)生的RNA與DNA形成的雜交雙螺旋長度有限，在轉(zhuǎn)錄過程中，從轉(zhuǎn)錄泡伸出的是單鏈RNA，而在復(fù)制過程中，從DNApol上伸展出來的是DNA雙鏈分子。⑥RNApol啟動轉(zhuǎn)錄需要識別啟動子，轉(zhuǎn)錄的起始階段受到多種調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)。本文檔共46頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\15點37分轉(zhuǎn)錄的起始與延伸（1）RNApol全酶與雙鏈DNA的非特異性結(jié)合，沿DNA滑動掃描，直到發(fā)現(xiàn)啟動子序列。（2）RNApol與啟動子形成封閉復(fù)合物。（3）封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)化成開放復(fù)合物。

σ因子使DNA部分解鏈，形成轉(zhuǎn)錄泡，使DNA模板鏈進(jìn)入活性中心。（4）RNA合成的起始第一個摻入的核苷酸總是嘌呤核苷酸。本文檔共46頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\15點37分

從封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)化成開放復(fù)合物后，β鉗子和β'鉗子牢固地固定了下游DNA，σ因子的1.1區(qū)域移動了約5nm的距離，使DNA可以進(jìn)入鉗狀結(jié)構(gòu)的裂隙中。非模板鏈離開酶的活性中心進(jìn)入非模板鏈通道(NT)，模板鏈則穿過酶的活性中心進(jìn)入模板鏈通道(T)，新合成的RNA通過RNA出口通道從酶的活性中心伸出(圖7-5)。本文檔共46頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\15點37分

轉(zhuǎn)錄泡的維持需要DNA在轉(zhuǎn)錄泡前面解鏈，同時在轉(zhuǎn)錄泡后面重新形成雙鏈，拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠在轉(zhuǎn)錄泡的前方解除因解鏈形成的正超螺旋，在轉(zhuǎn)錄泡的后方解除因解鏈形成的負(fù)超螺旋(圖7-6)。本文檔共46頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\15點37分7.2.4轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄終止于具有終止功能的特定DNA序列，這一特定的序列稱作終止子(terminator)。協(xié)助RNApol識別終止子的輔助因子(蛋白質(zhì))稱終止因子(terminationfactor)。根據(jù)終止子結(jié)構(gòu)的特點和其作用是否依賴于終止因子，將E.coli的終止子分為兩類。一類稱為不依賴于ρ因子的終止子，屬于強(qiáng)終止子。另一類為依賴于ρ因子的終止子，屬于弱終止子。

本文檔共46頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\15點37分7.2.4.1不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

不依賴于ρ因子的終止子(Rho-independentterminator)通常有一回文對稱序列，該序列轉(zhuǎn)錄生成的RNA能形成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，可終止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄作用。(圖7-8)。本文檔共46頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\15點37分7.2.4.2依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

依賴于ρ因子的終止子(Rho-dependentterminator)，其回文對稱序列中不含GC區(qū)，其下游也無一串U序列。這一結(jié)構(gòu)所形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是一類弱終止子。本文檔共46頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\15點37分本文檔共46頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\15點37分7.3真核生物的轉(zhuǎn)錄7.3.1真核生物轉(zhuǎn)錄的特點

真核生物的轉(zhuǎn)錄過程大致分為裝配、起始、延伸和終止四個階段。裝配與起始階段與原核生物差異較大

(1)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。染色質(zhì)和核小體的結(jié)構(gòu)必須發(fā)生某種有利于轉(zhuǎn)錄的變化，進(jìn)入轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。

本文檔共46頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\15點37分 (2)RNApol的差別。真核生物有3種RNApol。真核生物的RNApol具有更多的亞基，不能直接識別啟動子，無解鏈酶活性。線粒體和葉綠體RNApol與原核生物類似。

(3)轉(zhuǎn)錄起始的差別在轉(zhuǎn)錄的起始階段，有多種順式作用元件和反式作用因子相互作用，才能裝配成起始復(fù)合物。

本文檔共46頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\15點37分 (4)轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)關(guān)系的差別原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄與翻譯在時間和空間上存在偶聯(lián)關(guān)系。而在真核細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核，翻譯則發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)，兩者不存在偶聯(lián)關(guān)系。

(5)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差別真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物多為單順反子，而原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大多數(shù)為多順反子。原因：原核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中功能相關(guān)的基因共享一個啟動子。而在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)之中，每一個蛋白質(zhì)的基因都有自己獨立的啟動子。本文檔共46頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\15點37分幾個重要的概念1、順式作用元件（cis-actingelement）

與結(jié)構(gòu)基因連鎖、并調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的DNA序列。2、反式作用因子（trans-actingfactor）

能與順式作用元件直接或間接辨認(rèn)、結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱。3、轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionalfactor):直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的反式作用因子。本文檔共46頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\15點37分7.3.2真核生物的RNA聚合酶真核生物的3種RNApol均由10多種亞基組成。本文檔共46頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\15點37分酶定位轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)物對α-鵝膏蕈堿的敏感性RNApolI核仁1種～3種5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA不敏感(>10-3mol/L)RNApolII核質(zhì)8種以上hnRNA和snRNA高度敏感(10-9～10-8mol/L)RNApolIII核質(zhì)4種以上tRNA、5SrRNA、U6snRNA和scRNA中度敏感(10-5～10-4mol/L)線粒體RNApol線粒體2種線粒體RNA不敏感葉綠體RNApol葉綠體3種以上葉綠體RNA不敏感表7-1真核細(xì)胞三種RNA聚合酶的某些性質(zhì)本文檔共46頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\15點37分 RogerKornberg因其在真核生物轉(zhuǎn)錄機(jī)制方面出色的研究工作，榮獲了2006年的諾貝爾化學(xué)獎。

真核生物的RNApol雖然亞基組成與原核生物的RNApol明顯不同，但其空間結(jié)構(gòu)是非常相似的。本文檔共46頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\15點37分7.3.3RNA聚合酶II催化的轉(zhuǎn)錄7.3.3.1RNA聚合酶II的啟動子

RNApolII催化的轉(zhuǎn)錄受各種順式作用元件的控制，包括核心啟動子、調(diào)控元件(regulatoryelements)、增強(qiáng)子和沉默子。

本文檔共46頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\15點37分(1)核心啟動子(corepromoter)也稱基礎(chǔ)啟動子(basalpromoter或minimalpromoter)，其功能是招募和定位RNApolII到轉(zhuǎn)錄起始點。屬于核心啟動子的元件有TATA盒、起始子(initiator,Inr),TFIIB識別元件(TFIIBrecognitionelement,BRE)，下游啟動子元件(downstreampromoterelement,DPE)和GC盒。本文檔共46頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\15點37分(2)上游元件上游元件包括上游臨近元件(upstreamproximalelements,UPE)和上游誘導(dǎo)元件(upstreaminducibleelements,UIE)。UPE的功能是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的效率。本文檔共46頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\15點37分7.3.3.2RNA聚合酶II催化的轉(zhuǎn)錄過程（1）RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄因子

RNApolII的轉(zhuǎn)錄因子有兩類，一類為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscriptionfactors)或通用轉(zhuǎn)錄因子(generatranscriptionfactors,GTFs)，另一類屬于特異性轉(zhuǎn)錄因子(specifictranscriptionfactors)。前者為所有的蛋白質(zhì)基因表達(dá)所必需，后者為特定的基因表達(dá)所必需。

RNApolII的GTFs種類較多，其主要功能是識別和結(jié)合核心啟動子，招募RNApolII正確地與啟動子結(jié)合，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用與其他上游元件或反式作用因子結(jié)合，形成前起始復(fù)合物(pre-initiationcomplex,PIC)。本文檔共46頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\15點37分表7-2RNApolII的通用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子亞基數(shù)目功能TFIID1TBP11TAFs與TATA盒結(jié)合，有調(diào)節(jié)功能。TFIIA3穩(wěn)定TBP與啟動子的結(jié)合TFIIB1招募RNApolII，確定轉(zhuǎn)錄起點。TFIIF2與RNApolII結(jié)合，穩(wěn)定聚合酶與DNA的結(jié)合，確定模板鏈。TFIIE2協(xié)助招募TFIIH，促進(jìn)啟動子的解鏈。TFIIH9具有ATP酶、解鏈酶和CTD激酶活性，促進(jìn)啟動子解鏈和清空。TFIIS1激活RNApolII的剪切活性，參與轉(zhuǎn)錄的校對。本文檔共46頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\15點37分RNAPolII前體復(fù)合物的組裝：中介因子參與了轉(zhuǎn)錄激活因子與前起始復(fù)合物的作用，還可以破壞核小體結(jié)構(gòu)。本文檔共46頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\15點37分如圖7-14所示，在形成PIC（pre-initiationcomplex）時，轉(zhuǎn)錄因子及RNApolII與啟動子結(jié)合的次序可能是：TFIID→TFIIA→TFIIB→(TFIIF+RNApolII)→TFIIE→TFIIH。（2）RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的過程本文檔共46頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\15點37分

②RNA鏈的延伸PIC形成以后，DNA很快被解鏈，使PIC由封閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變成開放狀態(tài)，并開始合成RNA。

③轉(zhuǎn)錄的終止當(dāng)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行到3'-末端，遇到終止信號或終止子序列時，RNApolII的CTD在TFIIF的作用下去磷酸化，轉(zhuǎn)錄隨即終止。本文檔共46頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\15點37分7.4轉(zhuǎn)錄校對

RNApol缺乏3'-核酸外切酶活性，因此無法進(jìn)行校對。轉(zhuǎn)錄過程中有另外的兩種校對機(jī)制，可以保障轉(zhuǎn)錄的忠實性。

(1)焦磷酸解編輯(pyrophosphorolyticediting)使用聚合酶的活性中心，以逆反應(yīng)形式，通過重新?lián)饺虢沽姿幔コe誤插入的核苷酸。

(2)水解編輯(hydrolyticediting)需要聚合酶倒退若干個核苷酸，然后，通過特殊的蛋白質(zhì)切除3'-端包括錯配核苷酸在內(nèi)的幾個核苷酸，細(xì)菌行使切除功能的是GreA和GreB，真核生物則由TFIIS激活RNApolII的剪切活性。本文檔共46頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\15點37分7.5轉(zhuǎn)錄過程的選擇性抑制

RNA轉(zhuǎn)錄的抑制劑包括堿基類似物，DNA模板功能的抑制劑，和RNA聚合酶的抑制劑。7.5.1堿基類似物

有些人工合成的堿基類似物能抑制和干擾RNA的合成，如：6-巰基嘌呤等。這些堿基類似物可以直接抑制合成核苷酸的關(guān)鍵酶，或者摻入核酸分子，形成異常的DNA或RNA，從而影響核酸的功能并導(dǎo)致突變。