微生物生長繁殖

關(guān)于微生物生長繁殖第1頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三本章內(nèi)容一、生物生長的測定1.以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定2.以生物量為指標測定微生物的生長二、

細菌的群體生長繁殖1.生長曲線2.同步培養(yǎng)3.連續(xù)培養(yǎng)三、

微生物生長繁殖的控制1.控制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)2.控制微生物生長的物理因素第2頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三要求：通過本章的課堂教學(xué)，使學(xué)生了解微生物生長繁殖的規(guī)律，掌握微生物生長的測定方法，及各種物理、化學(xué)因素對微生物生長的影響。

第3頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定（一）微生物生長概述（二）以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定（三）以生物量為指標測定微生物的生長要求：掌握微生物生長的常規(guī)測定方法（原理和操作）

第4頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定生長：個體體積的增加繁殖：個體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。在微生物學(xué)中提到的“生長”，一般均指群體生長，這一點與研究大生物時有所不同。細菌太小，往往討論其群體生長。（一）微生物生長概述第5頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定細菌個體生長包括細胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制和再生、細胞分裂和控制。（一）染色體復(fù)制和分離雙向復(fù)制復(fù)制附著點在CM上，隨CM生長和細胞分裂而分離，形成兩個子細胞。（一）微生物生長概述第6頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定（二）CW擴增桿菌中是新合成的肽聚糖在新舊Cw均有分布，而球菌是在赤道板插入，固定位置。（三）細菌分裂與調(diào)節(jié)各種物質(zhì)復(fù)制后，質(zhì)膜內(nèi)陷伴隨新肽聚糖插入，導(dǎo)致橫隔壁向心生長，最后會合，一分為二。調(diào)節(jié)主要依賴轉(zhuǎn)肽酶和D，D－羧肽酶活性比。轉(zhuǎn)肽酶活性高些，利于CW擴增，導(dǎo)致細菌生長。羧肽酶高些，利于橫隔壁形成，導(dǎo)致細胞分裂。第7頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定第8頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定微生物生長的測定：個體計數(shù)：生物量測定：重量測定、生理指標測定（二）以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定通常用來測定細菌、酵母菌等單細胞微生物的生長情況或樣品中所含微生物個體的數(shù)量（細菌、孢子、酵母菌）第9頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定1、稀釋平板計數(shù)法對樣品進行適當稀釋→

單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖→

肉眼可見的菌落→

對菌落數(shù)目的計數(shù)推測樣品中的微生物細胞數(shù)（二）以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定第10頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定2、涂布平板法使用較多的常規(guī)方法，但有時涂布不均勻！（一般0.2ml）（二）以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定同一稀釋度三個以上重復(fù),取平均值；每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液；樣品充分混勻；每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于準確計數(shù)；要求：每ml活菌數(shù)＝同一稀釋度平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5注意：要三個以上重復(fù)平板平均計數(shù)；不適合絲狀菌第11頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定3.顯微鏡直接計數(shù)法采用細菌計數(shù)板或血球計數(shù)板，顯微鏡下直接計數(shù)（計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量）。（二）以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定每ml原液含菌數(shù)＝每小格平均菌數(shù)×400×1000×稀釋倍數(shù)第12頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定顯微鏡直接計數(shù)法缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；第13頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定（三）以生物量為指標測定微生物的生長1、比濁法在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。注意：測量應(yīng)在菌濃度與O.D.成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準第14頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定2、重量法以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量；通過樣品中蛋白質(zhì)、核酸含量的測定間接推算微生物群體的生物量；測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法（三）以生物量為指標測定微生物的生長第15頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、生物生長的測定3、生理指標法呼吸強度耗氧量酶活性與其群體的規(guī)模成正相關(guān)生物熱樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設(shè)備來測定相應(yīng)的指標。（三）以生物量為指標測定微生物的生長第16頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖生長曲線：細菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細胞數(shù)量，以培養(yǎng)時間為橫座標，以菌數(shù)為縱座標作圖，得到的一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。包括：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期1.遲緩期（lagphase）細胞分裂之前的準備，適應(yīng)環(huán)境。將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。也稱延遲期、適應(yīng)期。（一）生長規(guī)律第17頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一條典型的生長曲線至少可以分為

遲緩期，對數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期等四個生長時期第18頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖延緩期特點：細胞形態(tài)變大或增長，例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于遲緩期的細菌細胞體積最大；細胞內(nèi)RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。對外界不良條件反應(yīng)敏感。（一）生長規(guī)律第19頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖減少遲緩期時間措施：（1）遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性（2）用對數(shù)生長期的做種子（3）接種前后培養(yǎng)基成分不要相差太大（4）適當擴大接種量（一）生長規(guī)律第20頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖2.對數(shù)生長期（logphase）這時的細菌代謝活性、酶活性穩(wěn)定且高；大小一致；生活力強；用做種子和實驗材料。3.穩(wěn)定期（stationaryphase）生長率為0，菌數(shù)最多并維持穩(wěn)定，積累代謝產(chǎn)物的好時期。（一）生長規(guī)律第21頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖對數(shù)期到穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)變是細胞重要的分化調(diào)節(jié)階段：

1）開始儲存糖原等內(nèi)含物；

2）形成芽孢或建立自然感受態(tài)（芽孢桿菌）

3）發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段；

某些放線菌抗生素的大量形成也在此時期（一）生長規(guī)律生產(chǎn)上延長穩(wěn)定期的方法：補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）或取走代謝產(chǎn)物；調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度；對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩第22頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖4.衰亡期（deathphase）特點：細菌代謝活性降低；細菌衰老并出現(xiàn)自溶；產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物；如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。菌體細胞也呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時產(chǎn)生畸形，細胞大小懸殊；有些革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌此時會變成陰性反應(yīng)（一）生長規(guī)律第23頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖不同的微生物或同一種微生物對不同物質(zhì)的利用能力是不同的。有的物質(zhì)可直接被利用(例如葡萄糖或NH+4等)；有的需要經(jīng)過一定的適應(yīng)期后才能獲得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常稱為速效碳源（或氮源），后者稱為遲效碳源（或氮源）。當培養(yǎng)基中同時含有這兩類碳源（或氮源）時，微生物在生長過程中會形成二次生長現(xiàn)象。（一）生長規(guī)律第24頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間為代時(Generationtime)。代時通常以G表示。在群體生長里細菌數(shù)量增加一倍所需的時間稱為倍增時間（Doublingtime)。（二）生長數(shù)學(xué)模型dNdt＝μNN：每毫升培養(yǎng)液中細胞數(shù)μ：比生長速率，每單位數(shù)量細菌在單位時間增加的量t：培養(yǎng)時間

t1–t00.639G=——————=—————nm第25頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖使群體中不同步的轉(zhuǎn)變?yōu)橥缴L或繁殖的方法。常用來科學(xué)研究和做種子。通過同步培養(yǎng)方法獲得的細胞被稱為同步細胞或同步培養(yǎng)物。分為：機械法

環(huán)境條件控制法

（三）同步培養(yǎng)第26頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖1、機械法根據(jù)不同階段細胞體積與質(zhì)量或跟某種材料結(jié)合程度不同。（1）離心法（2）過慮分離法（3）硝酸纖維素膜法（三）同步培養(yǎng)第27頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長的方法第28頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖2.環(huán)境條件控制法（1）溫度（2）培養(yǎng)基成分控制（3）其他，如：光（三）同步培養(yǎng)由于細胞的個體差異，同步生長往往只能維持2-3個世代，隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機生長。第29頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖采取一定措施使微生物以恒定比生長速率生長并持續(xù)。培養(yǎng)過程中不斷的補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。（四）連續(xù)培養(yǎng)dNdt=μN菌數(shù)增加速率dNdt=DN菌數(shù)減少速率第30頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖D：稀釋率，即培養(yǎng)基每小時流過培養(yǎng)容器的體積數(shù)μ>D，細菌數(shù)會增加，營養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致細菌停止生長。μ

＝D，維持平衡μ<D，菌被稀釋（四）連續(xù)培養(yǎng)第31頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖連續(xù)培養(yǎng)兩種類型：恒化器連續(xù)培養(yǎng)、恒濁器連續(xù)培養(yǎng)恒化：某種營養(yǎng)物質(zhì)維持恒定恒濁：菌恒定（四）連續(xù)培養(yǎng)第32頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖恒濁器連續(xù)培養(yǎng)（四）連續(xù)培養(yǎng)測定所培養(yǎng)微生物的光密度值自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度當培養(yǎng)室中的濁度超過預(yù)期數(shù)值時，流速加快，使?jié)岫冉档?；當培養(yǎng)室中的濁度低于預(yù)期數(shù)值時，流速減慢，使?jié)岫壬?；?3頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖恒濁器連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)發(fā)酵優(yōu)點：缺點：（四）連續(xù)培養(yǎng)一般用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；便于自動控制；降低動力消耗及體力勞動強度；產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；雜菌污染和菌種退化第34頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、群體生長繁殖恒化器連續(xù)培養(yǎng)使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率下進行生長繁殖。恒化連續(xù)培養(yǎng)中，必需將某種必需的營養(yǎng)物質(zhì)控制在較低的濃度，作為限制性因子，而其他營養(yǎng)物均過量。限制性因子必須是機體生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如aa和氨等氮源，或G、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，一定濃度范圍內(nèi)決定細菌生長速率。（四）連續(xù)培養(yǎng)第35頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三三、環(huán)境對生長影響環(huán)境對生長影響1.營養(yǎng)物質(zhì)2.水活性3.溫度影響：酶活性、CM流動性、物質(zhì)溶解度4.pH5.氧第36頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三四、生長繁殖控制控制（有害）微生物的生長速率或消滅不需要的微生物，在實際應(yīng)用中具有重要的意義。抑制：亞致死劑量因子作用使生長停止死亡：生長能力不可逆喪失防腐：理化因素防止或抑制微生物生長消毒：殺死或滅活所有病原微生物滅菌：殺死包括芽孢在內(nèi)的所有菌化療：選擇毒性化學(xué)物質(zhì)對生物體內(nèi)部感染組織或細胞進行治療，對機體本身無毒害作用。第37頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三四、生長繁殖控制1.抗微生物劑（antimicrobialagent）殺死或抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)。分以下幾種：抑菌劑（bacteriostaticagent）：抑制生長不能殺死殺菌劑（bactericide）：殺死不裂解細胞溶菌劑（bacteriolysis）：誘導(dǎo)細胞裂解（一）控制微生物的化學(xué)物質(zhì)第38頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三四、生長繁殖控制消毒劑：可殺死微生物，通常用于非生物材料的滅菌或消毒。防腐劑：能殺死微生物或抑制其生長，但對人及動物的體表組織無毒性或毒性低，可作為外用抗微生物藥物。抗微生物劑又叫殺菌劑，分消毒劑和防腐劑。第39頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三四、生長繁殖控制2.抗代謝物生長因子的結(jié)構(gòu)類似物干擾達到抑制微生物生長目的。如：葉酸對抗物（磺胺）、

嘌呤對抗物（6-巰基嘌呤）、苯丙氨酸對抗物（對氟苯丙氨酸）、尿嘧啶對抗物（5-氟尿嘧啶）胸腺嘧啶對抗物（5-溴胸腺嘧啶）等等第40頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三四、生長繁殖控制3.抗生素（antibiotic）某些生物合成或半合成的次級代謝產(chǎn)物或衍生物，抑制或殺死其他微生物。主要通過：抑制CW合成、破壞CM、作用呼吸鏈、抑制Pr核酸合成。第41頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第42頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第44頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第45頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三四、生長繁殖控制導(dǎo)致抗藥性菌株：細胞質(zhì)膜透性改變：使抗生素不進入細胞或進入細胞