四種外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的探究課件

農(nóng)桿菌介導的不同大豆外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究導師：王罡教授學生：鐘影

時間：2012年11月15日1研究背景及目的意義2研究內(nèi)容3技術路線4目前工作進展5實驗進度及安排研究背景大豆[Glycinemax(L.)Merrill］是世界上最重要的油料作物和高蛋白糧食作物之一，也是人類植物性蛋白和油脂的重要來源并在維持地球生物圈氮循環(huán)具有重要的作用。草甘膦（Glyphosate），學名N-(膦?；谆?氨基乙酸，只有極少數(shù)的雜草對它具有抗性，成為世界上生產(chǎn)使用量最大的除草劑品種。草甘膦作用機理是抑制植物體中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSPS）的活性，使植物體芳香族氨基酸合成受阻，致使植物死亡。農(nóng)桿菌介導的大豆遺傳轉(zhuǎn)化是國內(nèi)外應用最為成熟、操作簡便的轉(zhuǎn)化方法。至今，研究者們已經(jīng)利用大豆子葉節(jié)、成熟胚、胚尖、下胚軸、未成熟子葉、初生葉、花絮等獲得了轉(zhuǎn)基因大豆再生植株，但不同外植體的轉(zhuǎn)化效率各不相同。其中，尤以子葉節(jié)、胚尖兩種外植體研究較為深入，子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化體系最為成熟，但轉(zhuǎn)化效率沒有較大突破。目的意義本研究旨在對國內(nèi)常用的幾種大豆外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系進行系統(tǒng)研究，通過研究在農(nóng)桿菌介導下，不同類型外植體在不定芽誘導率、植株再生率、除草劑敏感性及基因轉(zhuǎn)化效率等方面的差異，以期獲得抗除草劑大豆轉(zhuǎn)基因植株并建立一種相對穩(wěn)定、高效的的大豆轉(zhuǎn)化體系，為進一步研究改進提供參考，為大豆的轉(zhuǎn)基因育種提供技術支撐。

研究內(nèi)容不同外植體除草劑篩選濃度的探究大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化生長點非離體微創(chuàng)轉(zhuǎn)化體系的探究大豆四種外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的探究除草劑篩選濃度探究

基因型：黑農(nóng)37、合豐35外植體：子葉節(jié)、胚尖、下胚軸預期濃度梯度：胚尖：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L子葉節(jié)：0、3、6、9、12、15、20mg/L下胚軸：0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mg/L評價指標：不定芽誘導率、不定芽長

研究內(nèi)容不同外植體除草劑篩選濃度的探究大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化生長點非離體微創(chuàng)轉(zhuǎn)化體系的探究大豆四種外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的探究胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化基因型：黑農(nóng)37、合豐35優(yōu)化條件超聲波輔助轉(zhuǎn)化時間：0、2、4、6、8、10min預培養(yǎng)時間梯度：0、1、2、3d抗氧化劑DTT、硫代硫酸鈉、L-cys、硝酸銀評價指標不定芽誘導率、基因轉(zhuǎn)化效率、褐化率

研究內(nèi)容不同外植體除草劑篩選濃度的探究大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化生長點非離體微創(chuàng)轉(zhuǎn)化體系的探究大豆四種外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的探究生長點非離體微創(chuàng)轉(zhuǎn)化體系的探究

基因型：黑農(nóng)37、合豐35探究因素：成熟胚培養(yǎng)時間2、3、4、5d(根據(jù)胚軸伸長情況而定)重懸液種類無菌水、1/2MS鹽、1/10MS鹽、MS鹽轉(zhuǎn)化位點植株每個位節(jié)做PCR檢測，為T1代檢測做基礎評價標準轉(zhuǎn)化率、再生率

研究內(nèi)容不同外植體除草劑篩選濃度的探究大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化生長點非離體微創(chuàng)轉(zhuǎn)化體系的探究大豆四種外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的探究四種外植體遺傳轉(zhuǎn)化體系的探究

載體：帶有EPSPS、Bar基因的PSOY20載體基因型黑農(nóng)37、合豐35外植體子葉節(jié)、胚尖、下胚軸、半種子評價標準不定芽誘導率、植株再生率、除草劑敏感性及基因遺傳轉(zhuǎn)化效率總體技術路線分子鑒定挑選大豆氯氣消毒挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于YEP中，28℃搖床過夜培養(yǎng)1:10擴大培養(yǎng)，至OD600=0.5~0.6左右侵染共培養(yǎng)篩選、培養(yǎng)收集菌體制備重懸液外植體制備子葉節(jié)轉(zhuǎn)化過程胚尖轉(zhuǎn)化過程下胚軸轉(zhuǎn)化流程生長點非離體微創(chuàng)轉(zhuǎn)化體系的研究種子萌發(fā)共培養(yǎng)光照預培養(yǎng)植入蛭石目前工作進展黑農(nóng)37（已經(jīng)完成）從上到下，從左至右，草甘膦濃度依次為：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L胚尖遺傳體系優(yōu)化及轉(zhuǎn)化（進入檢測階段）成苗生根微創(chuàng)法（等待T0代種子，T1代檢測）現(xiàn)階段實驗進度及安排2012-03～2012-05試驗材料準備及農(nóng)桿菌驗證2012-06～2012-08除草劑濃度梯度篩選2012-09～2012-11黑農(nóng)37四種外植體的轉(zhuǎn)化及微創(chuàng)法實驗2012-12～2013-04基因型合豐35四種外植體的轉(zhuǎn)化及T0代播種實驗進度及安排2013-05～2013-08胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及T1代檢測2013-09～2013