植物組織培養(yǎng)的基本原理

關(guān)于植物組織培養(yǎng)的基本原理第1頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞全能性概述細(xì)胞脫分化細(xì)胞再分化第一節(jié)植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化第2頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三

植物細(xì)胞的全能性：1902年由Haberlandt提出，植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。（細(xì)胞核）

20世紀(jì)80年代，每一個(gè)植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。一、植物細(xì)胞的全能性（Totipotency）第3頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三從一個(gè)細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)植株繼代魚(yú)雷球形心形第4頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三植物細(xì)胞全能性的證明

1958年，美國(guó)斯圖爾德（Steward）等人，用胡蘿卜根韌皮部的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到了完整植株，并且這一植株能夠開(kāi)花結(jié)實(shí)，首次證實(shí)細(xì)胞全能性；1964年印度Guha和Maheshwari成功地在毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株。第5頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞全能性的相對(duì)性細(xì)胞全能性并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物;

植物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。細(xì)胞按照分裂能力分為3類第一類：始終保持分裂能力，如莖尖、根尖分生組織及形成層細(xì)胞；第二類：永久失去分裂能力的終端分化細(xì)胞，如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞；第三類：在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動(dòng)分裂的細(xì)胞，如表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。第6頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三一個(gè)植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過(guò)程所能進(jìn)行的程度，

取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。

營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中心

>形成層>薄壁細(xì)胞

>厚壁細(xì)胞（木質(zhì)化細(xì)胞）>特化細(xì)胞（篩管、導(dǎo)管細(xì)胞）第7頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞全能性脫分化個(gè)體再生再分化細(xì)胞分裂細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過(guò)細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）和再分化（redifferentiation）實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。第8頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、植物細(xì)胞分化1.

定義

分化（differentiation）植物體各個(gè)部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，體現(xiàn)在細(xì)胞分化、組織分化、器官分化三個(gè)水平上。細(xì)胞分化導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過(guò)程。是基因選擇性活化或阻遏的結(jié)果。細(xì)胞分化是組織分化和器官分化的基礎(chǔ)，是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。第9頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.植物細(xì)胞分化的某些規(guī)律和機(jī)理（1）細(xì)胞分化分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化兩類，生理生化分化在形態(tài)結(jié)構(gòu)分化之前。（2）植物中細(xì)胞發(fā)育的途徑一旦被“決定”（determination），通常不易改變。而離體培養(yǎng)可以通過(guò)脫分化而喪失這種“決定”。（3）分化與極性（Polarity）關(guān)系密切。

第10頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三（4）細(xì)胞分裂對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用。

特定環(huán)境條件下進(jìn)行的細(xì)胞分裂可以導(dǎo)致特定的細(xì)胞分化，由不均等分裂形成的分化細(xì)胞說(shuō)明了細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞分化中的作用。

（5）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有明顯調(diào)節(jié)作用。如生長(zhǎng)素類與細(xì)胞分裂素類比值，高，促進(jìn)生根；低，促進(jìn)長(zhǎng)芽。（6）染色體和DNA的變化對(duì)細(xì)胞分化影響比較大。如核內(nèi)多倍體的形成。細(xì)胞不分裂，只有遺傳物質(zhì)復(fù)制所導(dǎo)致的染色體組倍性增加的現(xiàn)象。第11頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.

脫分化（Dedifferentiation）也稱去分化，指離體條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或不分化細(xì)胞的過(guò)程。2.脫分化的機(jī)理

脫分化誘導(dǎo)期間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜透性改變，細(xì)胞核增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴(kuò)大，多核糖體形成，過(guò)氧化物酶增加，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)合成活躍等。但目前對(duì)于脫分化的機(jī)理尚未完全闡明。三、細(xì)胞脫分化第12頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.影響脫分化的主要因素（1）損傷。切割損傷的刺激，促使細(xì)胞增殖。（2）在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)常加入生長(zhǎng)素類，但同時(shí)配合細(xì)胞分裂素的效果可能更好。

（3）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細(xì)胞分裂。（4）細(xì)胞位置。外植體本身的各類細(xì)胞可能對(duì)培養(yǎng)條件的刺激有不同的敏感性。（5）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會(huì)有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。（6）植物種類的差異。一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。第13頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三１.愈傷組織的形成在細(xì)胞脫分化過(guò)程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的細(xì)胞往往是異質(zhì)性的，無(wú)明顯極性，其形成過(guò)程可分為誘導(dǎo)期、分裂期和分化期。

四、愈傷組織（callus）形成黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織第14頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三愈傷組織形成過(guò)程◆誘導(dǎo)期（起動(dòng)期）：是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。細(xì)胞大小幾乎不變，內(nèi)部發(fā)生生理生化變化，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸?！舴至哑冢和鈱蛹?xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成小芯。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細(xì)胞必然分化，及時(shí)轉(zhuǎn)移，其可無(wú)限制地進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不分化狀態(tài)?！舴只冢杭?xì)胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細(xì)胞。第15頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三概念

指離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，

形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至形成完整植株。

組織培養(yǎng)中的再分化包括下面4個(gè)水平細(xì)胞水平的再分化組織水平的再分化器官水平的再分化（器官發(fā)生）植株水平的分化（植株再生）五、細(xì)胞再分化（redifferentiation）第16頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞水平的再分化

愈傷組織生長(zhǎng)、不斷分裂，分化出不同的細(xì)胞類群。主要有薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞、石細(xì)胞、纖維細(xì)胞等。組織水平的再分化

在高水平生長(zhǎng)素條件下，最常見(jiàn)的是微管束（Vasculartissue）的分化。

松散的愈傷組織內(nèi)含大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；

致密的愈傷組織內(nèi)組織分化很少，大多由高度液泡化的細(xì)胞組成。

第17頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三器官水平的再分化

由分化出的不同組織形成各種器官，如芽、莖、葉、根等。

根據(jù)起源不同，分為兩種類型：◆直接器官發(fā)生（器官型）直接從外植體的細(xì)胞形成器官原基，然后發(fā)育成器官。◆間接器官發(fā)生（器官發(fā)生型）先形成愈傷組織，再由愈傷組織產(chǎn)生不同的器官原基，后形成不同器官。第18頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三植株水平的再分化（植株再生）

根、莖或芽器官的發(fā)生可使植株重建。先誘導(dǎo)分化出芽，后形成根較好。離體培養(yǎng)中再生植株的主要途徑有器官發(fā)生胚胎發(fā)生第19頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三潛力從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過(guò)再分化可獲得各種類型的細(xì)胞、組織、器官以及再生植株。但是目前，還不能讓所有植物的活細(xì)胞都再生植株。主要原因（1）不同植物種類再分化的能力差異很大；（2）對(duì)某些植物再生條件還沒(méi)有完全掌握。第20頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二節(jié)離體條件下植物器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生離體培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成根、芽、莖等器官的過(guò)程。不定根、不定芽在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷組織上發(fā)生的根或芽。第21頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、器官發(fā)生再生植株的方式

A.先形成芽，芽的基部產(chǎn)生根；

B.先形成根，根上再出芽；

C.愈傷組織的不同部位形成芽和根；然后形成微管束組織把兩者結(jié)合起來(lái)。第22頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三經(jīng)過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生過(guò)程二、器官發(fā)生的過(guò)程

分為2種經(jīng)過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生；不經(jīng)過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生。愈傷組織形成生長(zhǎng)中心形成器官原基及器官形成第23頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三不經(jīng)過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生過(guò)程

有2種情況

外植體直接發(fā)生芽；

莖尖培養(yǎng)中芽形成。第24頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三第三節(jié)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生

一、什么是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生？植物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官產(chǎn)生類似胚的結(jié)構(gòu)，其形成也經(jīng)歷一個(gè)類似合子胚胎發(fā)生和發(fā)育過(guò)程，這種現(xiàn)象稱為植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生，形成的類似胚的結(jié)構(gòu)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有普遍性，目前已在200多種被子植物上觀察到體胚發(fā)生過(guò)程。第25頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.發(fā)生過(guò)程雙子葉植物胚胎發(fā)生

合子－原胚－球形胚－心型胚－魚(yú)雷胚－子葉胚。單子葉植物胚胎發(fā)生

合子－原胚－球形胚－盾型胚－子葉胚。體細(xì)胞胚胎發(fā)生一般分為5個(gè)階段胚性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎早期分化發(fā)育、體細(xì)胞胚胎成熟、體細(xì)胞胚胎萌發(fā)和成苗。體細(xì)胞胚胎發(fā)生與合子胚發(fā)生階段類似，但體胚形成由體細(xì)胞（或小孢子等性細(xì)胞）形成。二、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程

第26頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三針葉松體細(xì)胞胚及體胚萌發(fā)生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的針葉松體細(xì)胞胚半固體培養(yǎng)基上針葉松體細(xì)胞胚萌發(fā)生長(zhǎng)第27頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三（1）胚性愈傷組織，通常較小，近圓形；具有較大的核和核仁，并高度染色；胞質(zhì)濃厚。典型的胚性愈傷組織外表呈松脆顆粒狀。胚性愈傷——“結(jié)構(gòu)致密，爽脆，顏色嫩黃光澤”，非胚性愈傷——水浸褐化狀。（2）胚性細(xì)胞

DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成更活躍，

淀粉、可溶性糖含量增加，

內(nèi)源多胺含量升高，

同工酶和內(nèi)源激素合成變化明顯。如胡蘿卜胚性愈傷組織淀粉含量高出非胚性愈傷組織的15~40倍。2.胚性和非胚性細(xì)胞或愈傷組織生理狀態(tài)的差異第28頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因表達(dá)機(jī)理植物體胚發(fā)生的過(guò)程非常復(fù)雜，牽涉到4000多個(gè)相關(guān)基因，體胚發(fā)育后期，表達(dá)的基因可達(dá)1000多個(gè)。在植物體胚發(fā)生過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)與基因表達(dá)有關(guān)的一系列生物大分子的有規(guī)律變化。如蛋白質(zhì)含量變化和特異蛋白質(zhì)（胚性蛋白）出現(xiàn)與消失。

目前對(duì)體胚發(fā)生的機(jī)制了解不多。第29頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑1.直接途徑從外植體某些部位(如子葉、花序、珠心等外植體)的胚性細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚胎。DirectsomaticembryogenesisinBrassicanapus蕓苔第30頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三外植體先脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織的某些細(xì)胞重新“決定”為胚性細(xì)胞，進(jìn)而分化出體細(xì)胞胚胎。多數(shù)體細(xì)胞胚胎通過(guò)該途徑形成的。通常包括2個(gè)階段：（1）胚胎發(fā)生叢（Embryogenicclump，EC）是由液泡小、細(xì)胞質(zhì)濃的小細(xì)胞構(gòu)成。（2）胚狀體的發(fā)育。將EC轉(zhuǎn)入降低或除去生長(zhǎng)素、降低還原氮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可。

2.

間接途徑第31頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三SomaticEmbryogenesisInductioninRaf(RoyalPoinciana)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚萌發(fā)第32頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.

體細(xì)胞胚胎的起源起源存在爭(zhēng)論，但絕大多數(shù)體細(xì)胞胚胎起源于單細(xì)胞。細(xì)胞胚發(fā)生的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞分化，細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)部分基因開(kāi)放，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。四、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的機(jī)理第33頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三

2.體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理

體胚特點(diǎn)◆極性單個(gè)胚性細(xì)胞第一次分裂多為不均等分裂，頂細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，基細(xì)胞進(jìn)行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。極性獲得的誘因是激素和外界刺激。

◆生理隔離在早期胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞存在胞間連絲，但是隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育，細(xì)胞壁加厚，胞間連絲消失或被堵塞（類似小孢子發(fā)生）。第34頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的的生理生化（1）蛋白質(zhì)與核酸代謝

胚性細(xì)胞DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成更活躍。（2）多胺代謝變化內(nèi)源多胺含量升高。（3）糖類、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)變化淀粉、可溶性糖含量增加，如胡蘿卜胚性愈傷組織淀粉含量高出非胚性愈傷組織的15~40倍（4）內(nèi)源激素變化同工酶和內(nèi)源激素合成變化明顯。（5）活性氧代謝變化第35頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.胚狀體的數(shù)量比不定芽多；2.胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和貯藏；3.胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。

胚狀體形成植株的優(yōu)點(diǎn)第36頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三第四節(jié)影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素一、植物種類和基因型

1.植物種類不同難易程度不同，被子植物比裸子植物容易。

2.同一物種不同基因型間存在較大差別。二、培養(yǎng)材料的生理狀態(tài)

1.發(fā)育年齡：一般幼態(tài)比老態(tài)組織形態(tài)發(fā)生能力高。

2.培養(yǎng)器官或組織類型：細(xì)胞分裂旺盛的器官較好。

3.培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍性：一般取處于旺盛生長(zhǎng)期的愈傷來(lái)誘導(dǎo)器官形成。第37頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、培養(yǎng)基1.營(yíng)養(yǎng)成分

一般認(rèn)為，培養(yǎng)基中的銨態(tài)氮和K+有利于胚狀體形成，提高無(wú)機(jī)磷的含量可促進(jìn)器官發(fā)生。

莖尖培養(yǎng)和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要是MS及其修改的培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基，莖尖培養(yǎng)的起始培養(yǎng)基和芽增殖的培養(yǎng)基往往是不同。

碳水化合物種類及濃度對(duì)胚狀體發(fā)育有重要作用。缺糖或低糖無(wú)法形成胚狀體。第38頁(yè)，講稿共43頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

（起主導(dǎo)作用，通過(guò)影響內(nèi)源激素的平衡起作用）（1）