高效液相色譜原理和操作詳解

高效液相色譜1985199019952000HPLC9鑒于HPLCHPLC HPLC系 固定相和流動(dòng) 流動(dòng)相的pH 鹵代應(yīng)特別注意的問 HPLC用 HPLC應(yīng) 一、對起草單位的要求 二、對復(fù)核單位的要求

色譜法最早是由植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressure Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。HPLC150~300Kg/cm275Kg/cm2以上。0.1~10.0ml/min。5000100種。0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。HPLC15~30min5min內(nèi)即法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLCGLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法（正相與反相）液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相反相色譜法一般用非極性固定相（C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最HPLC80%左右。pHpH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品pH1.5~10范圍操作。高～中～低～中～（如氨基鍵合固定相）離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣色譜圖(chromatogram時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile基線(baseline)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測器出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（Gauss曲線leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。拖尾因子(tailingfactor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)。《中國藥T0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。峰高(peakheight，h峰寬(peakwidth，W)——峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)半峰寬(peakwidthathalf-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation，σx＝±1時(shí)（拐點(diǎn)0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。h＝1.064Wh/2h定性參數(shù)（保留值HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時(shí)間。Vm3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）timetR濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0V'R＝F×t'R理論塔板數(shù)(theoreticaltenumber，N)——用于定量表示色譜柱的N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流N可近似表示為： N為常量時(shí)，WtR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分N與柱長成正比，柱越長，NN表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長，如果未若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N理論塔板高度(theoreticalteheight，H)——每單位柱長的方差。＝L和理論塔板數(shù)計(jì)算：H＝，H有效＝分配系數(shù)(distributioncoefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況很?。r(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜在同譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長，后流出HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH容量因子(capacityfactor，k)——化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，分配系數(shù)、容量因子與保留時(shí)間之間有如下關(guān)系：k＝＝＝K＝，t'R＝kt0。相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及Vs、Vm無關(guān)；kVs、Vm有關(guān)。t'R、t0Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。子之比。α＝＝（k2＞k1）k＝t'R/t0α＝α又稱為相對保性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，α的大小表值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝W1＝W2時(shí)，R＝。R＝14σ分離，兩峰基本分離，95.4，內(nèi)側(cè)峰基約2%。R＝1.5時(shí)，稱為6σ分離，露峰面積為99.7%。R≥1.5稱R1.5。α＝1時(shí)，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.pH值；b.改變柱溫；c.改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)現(xiàn)。k20時(shí)，R0；k2增大，Rk2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長，而且峰形變寬，會(huì)影響分離k21~102~5，窄徑柱可更小些。0色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（hA） t＝tRC有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)（σ一定），hC0（進(jìn)樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當(dāng)進(jìn)V(0~∞A＝×σ×Cmax＝C0?？梢夾相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C0Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計(jì)算。11956VanDeemterGiddingsSnyderVanDeemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱率方程（Giddings方程）：H＝2λdp＋＋\s\up5(2p＋\s\up5(2p＋\s\up5(2f渦流擴(kuò)散（eddydiffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分λλHPLC3~10μm，3~5μmRSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會(huì)使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小。總的分子擴(kuò)散（moleculardiffusion）。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子u為流動(dòng)相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長（u?。?，展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對峰形的影響較大。DmDm10-4~10-5HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引Dm進(jìn)行校正。γ0.6~0.7γ＝1。Cu又分為三項(xiàng)。Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰HmHsmd2pDm成反比。因Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，DsHsdf的平方深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子Hs可以忽略。Hu作圖，則有1mm/sσ2＝σ2柱內(nèi)＋σ2柱外＋σ2k小的組分（k＜2）峰形拖尾和峰寬增HPLCHPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置。機(jī)控制系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分。HPLCWaters公司、Agilent公司（HP公，輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSDml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào) 達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸 ，柱塞往復(fù)泵的液缸，可至0.1ml，因此易于和更換流動(dòng)相，特別400kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克（RSD0.1%0.2~0.3%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向Waters型HP1100型EliteP200型求RSD40004039.240.0泵的使用和注意事0.45μm）等濾器。泵的都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常后成適合于色譜柱保存和有利于泵的溶（對于反相鍵合硅膠固定相，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可進(jìn)樣時(shí)對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停柱效，且價(jià)格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（10MPa以上）；此外閥進(jìn)樣一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣（以Rheodyne公司的77257725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（5~10%50%（75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)5~10倍（3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，六通閥使用和注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45μm濾膜過濾，5~16萬/5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。是管壁效應(yīng)30倍粒徑的厚度。在一般的液70kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，0.2~20μm(5~10μm)，取決于填料粒度，目的10~20cm；③毛細(xì)管柱（microcolumn）0.2~0.5mm；④半產(chǎn)柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確填料粒度＞20μm時(shí)，干法填充柱較為合適；顆粒＜20μm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④±5%或±10%柱的使用和注意事①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械溫度的突然變化或者使色②應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從改變④選擇使用適宜的流動(dòng)相（pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可⑥經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行時(shí)，對2050~75ml。 在后兩種情況發(fā)生時(shí)擰開柱接頭用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mmODS柱宜用甲醇沖HPLC4~515分鐘。1mV·s/g。檢測限(detectiong/mlmg/ml；對質(zhì)量型檢測器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測器線性范圍(linearrange)：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范濃度）Waters996PDABCx，Bx=1時(shí)，為線性響應(yīng)。對大多數(shù)檢測器來說，x只在一1x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。寬是是是否否無無有無小小大小——難難無無無有無池體積：除色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10μl。在1~2μl甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張紫外檢測器(ultravioletV檢測器是HLC又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感可于色譜由于靈敏高因此既使是那些光吸收小消光系數(shù)低的V（實(shí)際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生漂移。1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑A＝1時(shí)的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。220~240nm0.40241~250nm0.20251~300nm0.10300nm0.05UV檢測器的工作原理是Lambert-BeerACL成I0為入射光強(qiáng)度，I為透射光強(qiáng)度，T為透光率，E(photodiodearraydetector，PDAD)。按光路系統(tǒng)來分，UV檢測器可分為單光路道）檢測器。PDAD80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測器，它可以對每個(gè)洗（如生物樣品、中草藥）劑檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L的積分儀計(jì)算并打印出峰高、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù)。80年代后，計(jì)算機(jī)技術(shù)聯(lián)網(wǎng)上處理數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：①、處理和分析數(shù)據(jù)HPLCK，但對分離pH2~8。kpH壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機(jī)填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質(zhì)疏水性pH13下反復(fù)沖洗。苯乙烯-苯耐pH+抗膨脹/++++++注：+++好++一般 Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而制得。5個(gè)/nm2，由于空間位阻效應(yīng)（不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上）40~50%的硅醇基 ），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾pH值對以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵pH=2~8的介質(zhì)中使用。常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18C18C18C18分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物可選擇極性鍵合相基鍵合相對雙鍵異Schiff堿。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)。離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecylsilane)是應(yīng)用最為廣泛的非極性 kk升高。因此，kN一般與流動(dòng)相的粘度成反比。所以選不能用于硅系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)100℃以下的流動(dòng)相。了純化分離，且會(huì)使柱子。C乙腈＝0.32C2＋0.57CC四氫呋喃＝0.66CC為不同與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強(qiáng)度相當(dāng)89%66%pHpH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)pH值越小，組kpHpKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；50mm