沙棗黃酮的提取及其抗氧化作用的研究

沙棗黃酮的提取及其抗氧化作用的研究【摘要】目的對(duì)沙棗黃酮的抗氧化作用進(jìn)行研究。方法以70%乙醇為溶劑，超聲輔助法提取沙棗中的黃酮，用比色法測(cè)定其含量為%；采用比色法測(cè)定沙棗黃酮對(duì)·OH、O-2·和DPPH·等3種自由基的清除作用。結(jié)果沙棗黃酮對(duì)3種自由基都有明顯的清除作用，清除能力為DPPH·O-2··OH。結(jié)論清除率與濃度存在明顯的量效關(guān)系，當(dāng)濃度為mg·ml-1時(shí)，其清除率·OH為%，O-2·為%，DPPH·為%。

【關(guān)鍵詞】沙棗；黃酮；抗氧化性

沙棗Elaeagnusangustifolia屬胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬(ElaeaglltL.)，耐鹽堿、生長(zhǎng)快、易繁殖，藥用價(jià)值高，在新疆的塔克拉瑪干沙漠及各河流沿岸(且末、若羌、民豐、英吉沙、阿克蘇)和伊犁、托克遜等地廣泛分布［1］。酮類(lèi)化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用［2,3］。近年來(lái)，世界上掀起了植物藥開(kāi)發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)倍受青睞，而黃酮類(lèi)化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目。但是關(guān)于沙棗黃酮抗氧化方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將沙棗黃酮對(duì)3種不同自由基的清除能力進(jìn)行了一個(gè)較為全面、系統(tǒng)的研究，從而探討沙棗黃酮的抗氧化作用，為進(jìn)一步篩選天然植物抗氧化劑奠定了一定的基礎(chǔ)。

1材料

試劑乙醇()，氫氧化鈉()，亞硝酸鈉()，硝酸鋁()，pHTris-HCl緩沖液()，%雙氧水()；7mmol·L-1鄰苯三酚()；pH磷酸鹽緩沖溶液。

儀器TDL-5型低速臺(tái)式離心機(jī)；賽多利斯電子天平；島津UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)；R-200型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器；eppendorf手動(dòng)可調(diào)程單道移液器；DL-360A型超聲波清洗器；SHZ-C型循環(huán)水真空泵；HH-S型恒溫水浴鍋。

2方法

黃酮的含量測(cè)定方法

對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解，定容于50ml容量瓶中，制得濃度為mg·ml-1的對(duì)照品溶液。

最大吸收峰的確定精確吸取蘆丁對(duì)照品溶液2ml,加5%亞硝酸鈉溶液ml，搖勻后靜置6min，加10%硝酸鋁溶液ml，搖勻后靜置6min，加10%氫氧化鈉溶液ml，用蒸餾水定容至10ml，搖勻，放置15min，于400～600nm波長(zhǎng)處掃描，結(jié)果在510nm處有最大吸收。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精確吸取mg·ml-1蘆丁對(duì)照品溶液，，，，，ml，分別加入5%亞硝酸鈉溶液ml搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液ml搖勻，放置6min，最后加入10%氫氧化鈉溶液ml，用蒸餾水定容至10ml，搖勻，放置15min，在510nm處測(cè)定其吸光度值。以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，得線(xiàn)性回歸方程：Y=-5，r=9。

黃酮的提取準(zhǔn)確稱(chēng)取粉末g，按料液比1∶10加入70%乙醇浸泡30min，超聲提取1h，過(guò)濾后得濾液和濾渣。濾渣再按上述方法提取2次，濃縮，定溶至50ml容量瓶，作為試樣液。

黃酮的含量測(cè)定取試樣液2ml于10ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液ml，搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁溶液ml，搖勻，放置6min；最后加入10%氫氧化鈉溶液ml，用蒸餾水定容至10ml，搖勻，放置15min；在510nm處測(cè)定其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得沙棗果肉黃酮含量為%。

自由基的生成及清除率的測(cè)定

羥自由基的生成及清除率的測(cè)定［4］精密量取mlPBS磷酸鹽緩沖溶液(pH=，下同)和ml蒸餾水于試管中，混勻作空白參比管；精密量取mlPBS，ml鄰二氮菲(mmol·L-1，下同)、mlFeSO4(mmol·L-1，下同)和ml蒸餾水于試管中，混勻作未損傷管；精密量取mlPBS，ml鄰二氮菲，mlFeSO4，ml蒸餾水和mlH2O2(%)于試管中，混勻作損傷管；精密量取mlPBS，ml樣品液和ml蒸餾水于試管中，混勻作樣品參比管；精密量取mlPBS、ml鄰二氮菲，mlFeSO4，ml黃酮試樣液和mlH2O2于試管中，混勻作樣品管。將上述試管置于恒溫水鍋中，37℃保溫60min，于波長(zhǎng)536nm處測(cè)吸光度(A)值，每種處理重復(fù)5次，用其平均值按下式計(jì)算羥自由基清除率。以VitC作對(duì)照。

羥自由基清除率=［(A樣品-A樣參)-(A損傷-A空參)］/(A未損-A損傷)×100%

超氧陰離子自由基的生成及清除率的測(cè)定［5］采用鄰苯三酚自氧化法，精密量取Tris-HCl緩沖溶液(50mmol·L-1，pH)ml和ml藥液于試管中，混勻后在室溫下平衡4min，然后于325nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)j；精密量取Tris-HCl緩沖溶液ml向其中加入3ml鄰苯三酚，反應(yīng)平衡4min，于325nm處測(cè)得反應(yīng)體系的吸光值A(chǔ)0。按照上述方法，精密量取mlTris-HCl緩沖溶液和ml藥液，混勻后在室溫下放置4min，立即加入3ml鄰苯三酚并開(kāi)始計(jì)時(shí)，以10mmol·L-1HCl為參比，于325nm處每隔30s測(cè)定反應(yīng)體系的吸光值A(chǔ)，共記錄前6min；實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，求其平均值。按下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率(I)。以VitC作對(duì)照。

I(%)=［(A0－A－Aj)/A0］×100%

DPPH·自由基的生成及清除率的測(cè)定［6,7］取上述黃酮試樣液2ml及濃度為2×10-4mol·L-1的DPPH溶液2ml先后加入同一具塞試管中，30min后以樣品提取溶劑為空白調(diào)零測(cè)定其吸光度Ai；測(cè)定2ml濃度為2×10-4mol·L-1的DPPH溶液與2ml70%乙醇混合液的吸光度Ac；再測(cè)定2ml黃酮提取液與2ml無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj,重復(fù)5次，求其平均值。根據(jù)下列公式計(jì)算沙棗黃酮提取液對(duì)DPPH的抑制率，即：抑制率(%)=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100﹪。

3結(jié)果

沙棗黃酮對(duì)羥自由基的清除作用沙棗黃酮對(duì)羥自由基的清除效果見(jiàn)1。

由圖1可知，沙棗黃酮對(duì)·OH自由基的清除作用始終表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性的清除作用，而且清除作用很強(qiáng)，遠(yuǎn)高于同濃度的VitC。

沙棗黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用沙棗黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果見(jiàn)圖2。

圖2表現(xiàn)的是反應(yīng)開(kāi)始1min時(shí)沙棗黃酮對(duì)O-2·的清除作用。由圖2可知，沙棗黃酮對(duì)O-2·有較強(qiáng)的清除能力，與同等條件下的VitC相比，效果顯著。當(dāng)樣品溶液濃度為mg·ml-1時(shí)，清除率已達(dá)到%。

沙棗黃酮對(duì)DPPH·自由基的清除作用沙棗黃酮對(duì)DPPH·自由基的清除效果見(jiàn)圖3。

以脂溶性抗氧化劑VitE作對(duì)照，研究了沙棗黃酮對(duì)DPPH·的清除作用。結(jié)果如圖3。由圖3可知,沙棗黃酮對(duì)DPPH·具有很明顯的清除作用，且清除效果隨著濃度的增加而增大，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同濃度的VitE。在濃度為mg·ml-1時(shí)，沙棗黃酮對(duì)DPPH·的清除率已經(jīng)遠(yuǎn)超過(guò)60%。

4結(jié)論

本研究表明，沙棗黃酮對(duì)·OH、O-2·和DPPH·均具有明顯的清除作用，而且對(duì)自由基的清除作用隨著黃酮液濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為mg·ml-1時(shí)，其清除率·OH為%,O-2·為%，DPPH·為%。沙棗黃酮有很強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)自由基的清除能力總體強(qiáng)弱趨勢(shì)是：DPPH·O-2··OH。

沙棗在新疆蘊(yùn)藏量大，是一種純天然綠色野生植物。因此，可以開(kāi)發(fā)沙棗作為日常生活中常用的飲品，這對(duì)預(yù)防和治療衰老性疾病有一定的作用，而沙棗黃酮提取液對(duì)多種自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，因此沙棗作為一種有效的自由基清除劑，是我們理想的天然抗氧化劑之一，具有很好的開(kāi)發(fā)前景。

【參考文獻(xiàn)】

1］劉天慰，張?zhí)旆?太原植物志［M］.北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

［2］黃鎖義，黎海妮，余美料，等.益母草總黃酮的提取及鑒別［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16(5):398.

［3］黃鎖義，覃成箭，姚小敏，等.洋蔥總黃酮的提取及鑒別［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(2):224.

［4］蔡仲軍，陳仕江，伊定華，等.不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草清除羥自由基作用的研究［J］.中草藥，2004，35(1):57.

［5］李明靜，慶偉霞，楊玉霞，等.七種天然黃酮類(lèi)化合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性［J］.化學(xué)研究，2006，17(4)：70.

［6］CHOICW，KIMSC，HWANGSS，etal.Antioxidanactivityandfreeradicalscavengingcapacitybetweenkoreanmedicinalplantsandflavonoidsb