沙棗黃酮的提取及其抗氧化作用的研究

沙棗黃酮的提取及其抗氧化作用的研究【摘要】目的對沙棗黃酮的抗氧化作用進行研究。方法以70%乙醇為溶劑，超聲輔助法提取沙棗中的黃酮，用比色法測定其含量為%；采用比色法測定沙棗黃酮對·OH、O-2·和DPPH·等3種自由基的清除作用。結(jié)果沙棗黃酮對3種自由基都有明顯的清除作用，清除能力為DPPH·O-2··OH。結(jié)論清除率與濃度存在明顯的量效關(guān)系，當濃度為mg·ml-1時，其清除率·OH為%，O-2·為%，DPPH·為%。

【關(guān)鍵詞】沙棗；黃酮；抗氧化性

沙棗Elaeagnusangustifolia屬胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬(ElaeaglltL.)，耐鹽堿、生長快、易繁殖，藥用價值高，在新疆的塔克拉瑪干沙漠及各河流沿岸(且末、若羌、民豐、英吉沙、阿克蘇)和伊犁、托克遜等地廣泛分布［1］。酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用［2,3］。近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點倍受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目。但是關(guān)于沙棗黃酮抗氧化方面的研究尚未見報道。本研究將沙棗黃酮對3種不同自由基的清除能力進行了一個較為全面、系統(tǒng)的研究，從而探討沙棗黃酮的抗氧化作用，為進一步篩選天然植物抗氧化劑奠定了一定的基礎(chǔ)。

1材料

試劑乙醇()，氫氧化鈉()，亞硝酸鈉()，硝酸鋁()，pHTris-HCl緩沖液()，%雙氧水()；7mmol·L-1鄰苯三酚()；pH磷酸鹽緩沖溶液。

儀器TDL-5型低速臺式離心機；賽多利斯電子天平；島津UV-2401PC型紫外分光光度計；R-200型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器；eppendorf手動可調(diào)程單道移液器；DL-360A型超聲波清洗器；SHZ-C型循環(huán)水真空泵；HH-S型恒溫水浴鍋。

2方法

黃酮的含量測定方法

對照品溶液的制備精密稱取蘆丁標準品適量，用甲醇溶解，定容于50ml容量瓶中，制得濃度為mg·ml-1的對照品溶液。

最大吸收峰的確定精確吸取蘆丁對照品溶液2ml,加5%亞硝酸鈉溶液ml，搖勻后靜置6min，加10%硝酸鋁溶液ml，搖勻后靜置6min，加10%氫氧化鈉溶液ml，用蒸餾水定容至10ml，搖勻，放置15min，于400～600nm波長處掃描，結(jié)果在510nm處有最大吸收。

標準曲線的繪制精確吸取mg·ml-1蘆丁對照品溶液，，，，，ml，分別加入5%亞硝酸鈉溶液ml搖勻，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液ml搖勻，放置6min，最后加入10%氫氧化鈉溶液ml，用蒸餾水定容至10ml，搖勻，放置15min，在510nm處測定其吸光度值。以吸收度為縱坐標，對照品溶液的濃度為橫坐標，得線性回歸方程：Y=-5，r=9。

黃酮的提取準確稱取粉末g，按料液比1∶10加入70%乙醇浸泡30min，超聲提取1h，過濾后得濾液和濾渣。濾渣再按上述方法提取2次，濃縮，定溶至50ml容量瓶，作為試樣液。

黃酮的含量測定取試樣液2ml于10ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液ml，搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁溶液ml，搖勻，放置6min；最后加入10%氫氧化鈉溶液ml，用蒸餾水定容至10ml，搖勻，放置15min；在510nm處測定其吸光度值。根據(jù)標準曲線計算得沙棗果肉黃酮含量為%。

自由基的生成及清除率的測定

羥自由基的生成及清除率的測定［4］精密量取mlPBS磷酸鹽緩沖溶液(pH=，下同)和ml蒸餾水于試管中，混勻作空白參比管；精密量取mlPBS，ml鄰二氮菲(mmol·L-1，下同)、mlFeSO4(mmol·L-1，下同)和ml蒸餾水于試管中，混勻作未損傷管；精密量取mlPBS，ml鄰二氮菲，mlFeSO4，ml蒸餾水和mlH2O2(%)于試管中，混勻作損傷管；精密量取mlPBS，ml樣品液和ml蒸餾水于試管中，混勻作樣品參比管；精密量取mlPBS、ml鄰二氮菲，mlFeSO4，ml黃酮試樣液和mlH2O2于試管中，混勻作樣品管。將上述試管置于恒溫水鍋中，37℃保溫60min，于波長536nm處測吸光度(A)值，每種處理重復5次，用其平均值按下式計算羥自由基清除率。以VitC作對照。

羥自由基清除率=［(A樣品-A樣參)-(A損傷-A空參)］/(A未損-A損傷)×100%

超氧陰離子自由基的生成及清除率的測定［5］采用鄰苯三酚自氧化法，精密量取Tris-HCl緩沖溶液(50mmol·L-1，pH)ml和ml藥液于試管中，混勻后在室溫下平衡4min，然后于325nm處測定吸光值A(chǔ)j；精密量取Tris-HCl緩沖溶液ml向其中加入3ml鄰苯三酚，反應平衡4min，于325nm處測得反應體系的吸光值A(chǔ)0。按照上述方法，精密量取mlTris-HCl緩沖溶液和ml藥液，混勻后在室溫下放置4min，立即加入3ml鄰苯三酚并開始計時，以10mmol·L-1HCl為參比，于325nm處每隔30s測定反應體系的吸光值A(chǔ)，共記錄前6min；實驗重復5次，求其平均值。按下式計算超氧陰離子自由基清除率(I)。以VitC作對照。

I(%)=［(A0－A－Aj)/A0］×100%

DPPH·自由基的生成及清除率的測定［6,7］取上述黃酮試樣液2ml及濃度為2×10-4mol·L-1的DPPH溶液2ml先后加入同一具塞試管中，30min后以樣品提取溶劑為空白調(diào)零測定其吸光度Ai；測定2ml濃度為2×10-4mol·L-1的DPPH溶液與2ml70%乙醇混合液的吸光度Ac；再測定2ml黃酮提取液與2ml無水乙醇混合液的吸光度Aj,重復5次，求其平均值。根據(jù)下列公式計算沙棗黃酮提取液對DPPH的抑制率，即：抑制率(%)=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100﹪。

3結(jié)果

沙棗黃酮對羥自由基的清除作用沙棗黃酮對羥自由基的清除效果見1。

由圖1可知，沙棗黃酮對·OH自由基的清除作用始終表現(xiàn)為濃度依賴性的清除作用，而且清除作用很強，遠高于同濃度的VitC。

沙棗黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用沙棗黃酮對超氧陰離子自由基的清除效果見圖2。

圖2表現(xiàn)的是反應開始1min時沙棗黃酮對O-2·的清除作用。由圖2可知，沙棗黃酮對O-2·有較強的清除能力，與同等條件下的VitC相比，效果顯著。當樣品溶液濃度為mg·ml-1時，清除率已達到%。

沙棗黃酮對DPPH·自由基的清除作用沙棗黃酮對DPPH·自由基的清除效果見圖3。

以脂溶性抗氧化劑VitE作對照，研究了沙棗黃酮對DPPH·的清除作用。結(jié)果如圖3。由圖3可知,沙棗黃酮對DPPH·具有很明顯的清除作用，且清除效果隨著濃度的增加而增大，且遠遠高于同濃度的VitE。在濃度為mg·ml-1時，沙棗黃酮對DPPH·的清除率已經(jīng)遠超過60%。

4結(jié)論

本研究表明，沙棗黃酮對·OH、O-2·和DPPH·均具有明顯的清除作用，而且對自由基的清除作用隨著黃酮液濃度的增加而增強。當濃度為mg·ml-1時，其清除率·OH為%,O-2·為%，DPPH·為%。沙棗黃酮有很強的抗氧化活性，對自由基的清除能力總體強弱趨勢是：DPPH·O-2··OH。

沙棗在新疆蘊藏量大，是一種純天然綠色野生植物。因此，可以開發(fā)沙棗作為日常生活中常用的飲品，這對預防和治療衰老性疾病有一定的作用，而沙棗黃酮提取液對多種自由基均具有較強的清除能力，因此沙棗作為一種有效的自由基清除劑，是我們理想的天然抗氧化劑之一，具有很好的開發(fā)前景。

【參考文獻】

1］劉天慰，張?zhí)旆?太原植物志［M］.北京:中國科學技術(shù)出版社，1992.

［2］黃鎖義，黎海妮，余美料，等.益母草總黃酮的提取及鑒別［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16(5):398.

［3］黃鎖義，覃成箭，姚小敏，等.洋蔥總黃酮的提取及鑒別［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(2):224.

［4］蔡仲軍，陳仕江，伊定華，等.不同產(chǎn)地冬蟲夏草清除羥自由基作用的研究［J］.中草藥，2004，35(1):57.

［5］李明靜，慶偉霞，楊玉霞，等.七種天然黃酮類化合物對超氧陰離子自由基的清除活性［J］.化學研究，2006，17(4)：70.

［6］CHOICW，KIMSC，HWANGSS，etal.Antioxidanactivityandfreeradicalscavengingcapacitybetweenkoreanmedicinalplantsandflavonoidsb