液相色譜質譜聯用的原理及應用

關于液相色譜質譜聯用的原理及應用第1頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三簡介

色譜質譜的在線聯用將色譜的分離能力與質譜的定性功能結合起來，實現對復雜混合物更準確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。色譜質譜聯用包括氣相色譜質譜聯用(GC-MS)和液相色譜質譜聯用(LC-MS)，液質聯用與氣質聯用互為補充，分析不同性質的化合物。

第2頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三液質聯用與氣質聯用的區(qū)別:

氣質聯用儀(GC-MS)是最早商品化的聯用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標準譜庫對比。

液質聯用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。

第3頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三Neutral101102103104105MolecularWeightIonicAnalytePolarityIonSprayAPCIGC/MS第4頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三現代有機和生物質譜進展

在20世紀80及90年代，質譜法經歷了兩次飛躍。在此之前，質譜法通常只能測定分子量500Da以下的小分子化合物。20世紀70年代，出現了場解吸（FD）離子化技術，能夠測定分子量高達1500~2000Da的非揮發(fā)性化合物，但重復性差。20世紀80年代初發(fā)明了快原子質譜法（FAB-MS），能夠分析分子量達數千的多肽。隨著生命科學的發(fā)展，欲分析的樣品更加復雜，分子量范圍也更大，因此，電噴霧離子化質譜法（ESI-MS）和基質輔助激光解吸離子化質譜法（MALDI-MS）應運而生。第5頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三目前的有機質譜和生物質譜儀，除了GC-MS的EI和CI源，離子化方式有大氣壓電離（API）（包括大氣壓電噴霧電離ESI、大氣壓化學電離APCI、大氣壓光電離APPI）與基質輔助激光解吸電離。前者常采用四極桿或離子阱質量分析器，統(tǒng)稱API-MS。后者常用飛行時間作為質量分析器，所構成的儀器稱為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特點是可以和液相色譜、毛細管電泳等分離手段聯用，擴展了應用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學、環(huán)境分析、食品檢驗、組合化學、有機化學的應用等；MALDI-TOF-MS的特點是對鹽和添加物的耐受能力高，且測樣速度快，操作簡單。第6頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三質譜原理簡介：

質譜分析是先將物質離子化，按離子的質荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號強度為縱坐標，離子質荷比為橫坐標所作的條狀圖就是我們常見的質譜圖。

第7頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三常見術語:質荷比:

離子質量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z.峰:

質譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度:

檢測器檢測到的離子信號強度.基峰:

在質譜圖中，指定質荷比范圍內強度最大的離子峰稱作基峰.總離子流圖；質量色譜圖；準分子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子第9頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三總離子流圖:在選定的質量范圍內，所有離子強度的總和對時間或掃描次數所作的圖,也稱TIC圖.第10頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三質量色譜圖指定某一質量(或質荷比)的離子其強度對時間所作的圖.利用質量色譜圖來確定特征離子，在復雜混合物分析及痕量分析時是LC/MS測定中最有用的方式。當樣品濃度很低時LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時，根據得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數值，觀察提取離子的質量色譜圖，檢驗直接進樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適，以后進行MRM等其他掃描方式的測定時可作為參考。第11頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100質量色譜圖總離子流圖第12頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三準分子離子:指與分子存在簡單關系的離子，通過它可以確定分子量.液質中最常見的準分子離子峰是[M+H]+或[M-H]-.在ESI中,往往生成質量大于分子量的離子如M+1,M+23,M+39,M+18......稱準分子離子,表示為:[M+H]+,[M+Na]+等第13頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三碎片離子：準分子離子經過一級或多級裂解生成的產物離子.碎片峰的數目及其豐度則與分子結構有關,數目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。第14頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三Ephedrine,MW=165第15頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三多電荷離子：

指帶有2個或更多電荷的離子,常見于蛋白質或多肽等離子.有機質譜中,單電荷離子是絕大多數,只有那些不容易碎裂的基團或分子結構-如共軛體系結構-才會形成多電荷離子.它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的.采用電噴霧的離子化技術,

可產生帶很多電荷的離子,最后經計算機自動換算成單質/荷比離子。第16頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三同位素離子由元素的重同位素構成的離子稱為同位素離子.各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現在質譜中,這對于利用質譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便,還可利用穩(wěn)定同位素合成標記化合物,如:氘等標記化合物,再用質譜法檢出這些化合物,在質譜圖外貌上無變化,只是質量數的位移,從而說明化合物結構,反應歷程等第17頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三如何看質譜圖：(1)確定分子離子,即確定分子量氮規(guī)則：含偶數個氮原子的分子，其質量數是偶數，含奇數個氮原子的分子，其質量數是奇數。與高質量碎片離子有合理的質量差，凡質量差在3~8和10~13，21~25之間均不可能，則說明是碎片或雜質。第18頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學式高分辨質譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式低分辨質譜利用元素的同位素豐度，例:第19頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三(3)峰強度與結構的關系豐度大反映離子結構穩(wěn)定在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強，含支鏈的地方易斷，這同有機化學基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。第20頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三不同類型有機物有不同的裂解方式相同類型有機物有相同的裂解方式,只是質量數的差異需要經驗記憶。第21頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三質譜解析的一般步驟(適于低分辨小分子譜圖,若已經是高分辨質譜圖得到元素組成更好)(1)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當(2)綜合樣品其他知識：例如熔點，沸點，溶解性等理化性質，樣品來源，光譜，波譜數據等.第22頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三(3)盡可能判斷出分子離子。(4)假設和排列可能的結構歸屬：高質量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(5)假設一個分子結構，與已知參考譜圖對照，或取類似的化合物，并作出它的質譜進行對比。第23頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三有機質譜的特點優(yōu)點:(1)定分子量準確，其它技術無法比。(2)靈敏度高，常規(guī)10-7—10-8g,單離子檢測可達10-12g。(3)快速，幾分甚至幾秒。(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對于難分離的混合物特別有效,其它技術無法勝任。(5)多功能，廣泛適用于各類化合物。第24頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三局限性:

(1)異構體，立體化學方面區(qū)分能力差。(2)重復性稍差，要嚴格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動手，須專人操作。(3)有離子源產生的記憶效應，污染等問題。(4)價格稍顯昂貴，操作有點復雜。第25頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三質譜儀器：

質譜儀由以下幾部分組成

數據及供電系統(tǒng)┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓進樣系統(tǒng)離子源質量分析器檢測接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系統(tǒng)

第26頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三真空系統(tǒng)

質譜儀的離子源、質量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應。所以質譜反應屬于單分子分解反應。利用這個特點，我們用液質聯用的軟電離方式可以得到化合物的準分子離子，從而得到分子量。由機械真空泵(前極低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達接收器，真空度不夠則靈敏度低。第27頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三進樣系統(tǒng)把分析樣品導入離子源的裝置，包括：直接進樣，GC，LC及接口，加熱進樣，參考物進樣等。第28頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三離子源使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置，并對離子進行加速使其進入分析器，根據離子化方式的不同，有機質譜中常用的有如下幾種，其中EI，ESI最常用。第29頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三EI(ElectronImpactIonization):電子轟擊電離—硬電離。CI(ChemicalIonization):化學電離—核心是質子轉移。FD(FieldDesorption):場解吸—目前基本被FAB取代。FAB(FastAtomBombardment):快原子轟擊—或者銫離子(LSIMS,液體二次離子質譜)。

ESI(ElectrosprayIonization):電噴霧電離—屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質分子多肽等)

APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大氣壓化學電離—同上，更適宜做弱極性小分子。APPI(AtmosphericPressurePhotoSprayIonization):大氣壓光噴霧電離—同上，更適宜做非極性分子。

MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時間質譜和FT-MS，特別適合蛋白質，多肽等大分子．第30頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三其中ESI，APCI，APPI統(tǒng)稱大氣壓電離(API)第31頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三實驗室現有的離子源:ESI電噴霧電離源APCI大氣壓化學電離源第32頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三第33頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三電噴霧（ESI）的特點

通常小分子得到[M+H]+]+,[M+Na]+或[M-H]-單電荷離子，生物大分子產生多電荷離子，由于質譜儀測定質/荷比，因此質量范圍只有幾千質量數的質譜儀可測定質量數十幾萬的生物大分子。電噴霧電離是最軟的電離技術，通常只產生分子離子峰，因此可直接測定混合物，并可測定熱不穩(wěn)定的極性化合物；其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質和DNA等生物大分子；通過調節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂（源內CID）測定化合物結構。第34頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三第35頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三大氣壓化學電離（APCI）特點

大氣壓化學電離也是軟電離技術，只產生單電荷峰，適合測定質量數小于2000Da的弱極性的小分子化合物；適應高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動相；通過調節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂。第36頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三電噴霧與大氣壓化學電離的比較

電離機理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質子轉移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。樣品流速：APCI源可從0.2到2ml／min；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1ml／min.斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.靈敏度：通常認為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子第37頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三NanoSpray離子源專門設計的NanoSpray離子源特別適合于做微量的生化樣品，其流速范圍可從5nL／min到luL／min。一滴樣品就可做數小時的分析?？稍谧钚〉臉悠废牧肯芦@得最大靈敏度。靈敏度可高達fmole。并可直接與微孔HPLC聯用。第38頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三正負離子模式:一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負離子測定模式可供選擇。根據樣品的性質選擇，也可兩種模式同時進行第39頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三質量分析器:是質譜儀中將離子按質荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質譜。第40頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三質量分析器的分類：雙聚焦扇形磁場-電場串聯儀器(sector).四極質譜儀(Q).飛行時間質譜儀(TOF).離子阱質譜儀（TRAP）付利葉變換-離子回旋共振質譜儀(FT-ICRMS).┏四極+TOF（Q-TOF）串列式多級質譜儀┫三重四極（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF第41頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三進行MS/MS的儀器從原理上可分為兩類第一類儀器利用質譜在空間中的順序，是由兩臺質譜儀串聯組裝而成。即前面列出的串列式多級質譜儀。第二類利用了一個質譜儀時間順序上的離子儲存能力，由具有存儲離子的分析器組成，如離子回旋共振儀（ICR）和離子阱質譜儀。但不能進行母離子掃描或中性丟失。第42頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三實驗室現有的質量分析器類型：串聯四極質譜儀(MS/MS)

：

三重四極（QqQ）離子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器

MS1MS2Q1q2Q3第44頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三QqQ儀器可以方便的改變離子的動能，因此掃描速度快，體積小，常作為臺式進入常規(guī)實驗室，缺點是質量范圍及分辨率有限，不能進行高分辨測定，只能做到單位質量分辨。（通過高分辨能得到化合物的分子式）第45頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三在液質聯機中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式輸送給分子離子，這個能量足以使得處在能量亞穩(wěn)態(tài)分子中的某些化學鍵斷裂并使一些特定的分子發(fā)生結構重排。第46頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三碰撞誘導解離CID質譜：選擇一定質量的離子作為母體離子，進入碰撞室，室內充有靶子反應氣體(碰撞氣體：N2、He、Ar、Xe、CH4等)，發(fā)生離子—分子碰撞反應，從而產生‘子離子’，再經MS2的分析器及接受器得到子離子質譜，一般稱做CID(collision-induceddissociation)譜第47頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三影響CID質譜的因素：較大影響的因素有：所用碰撞氣體的種類，壓力，離子的能量，儀器的配置以及離子電荷狀態(tài)由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品，任何一個給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質譜，尤其是各個離子峰的相對豐度的差別幾乎是無法避免的。因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用，只能進行人工解析或自己建庫。第48頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三大氣壓電離技術中產生的離子為偶數電子離子，其主要的碎片應由化學鍵的誘導斷裂和重排反應來產生，所以在EI質譜解析中總結出的偶數電子離子的開裂規(guī)則一般可適用于CID質譜的解釋。第49頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三檢測接收器：接收離子束流的裝置，有：電子倍增器、光電倍增器、微通道板第50頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三數據及供電系統(tǒng)將接收來的電信號放大、處理并給出分析結果及控制質譜儀個部分工作。從幾伏低壓到幾千伏高壓。第51頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化1.接口的選擇：

ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預先形成離子的化合物和可以獲得多個質子的大分子（如蛋白質）

APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。第52頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三2.正、負離子模式的選擇：選擇的一般原則為：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。第53頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三3.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調節(jié)pH值。LC／MS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10一5mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。第54頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三4.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul／min，應用4.6mm內徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm內徑的微柱，TIS源最高允許lml／min，建議使用200—400ul／minAPCI的最佳流速～lml／min，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。第55頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三5.輔助氣體流量和溫度的選擇

霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質譜的產生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20℃

左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機溶劑比例高時可采用適當低的溫度和流量小一點的。第56頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三樣品的預處理：為什么要進行樣品的預處理：從保護儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對分析結果的干擾。要求獲得最佳的分析結果，從ESI電離的過程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質在液滴表面存在競爭，不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量雜質防礙帶電樣品離子進入氣相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。第57頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三樣品的預處理常用方法a）超濾b）溶劑萃?。}c）固相萃取d）灌注（Perfusion）凈化／去鹽e）色譜分離反相色譜分離親和技術分離f）甲醇或乙腈沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化第58頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描）全掃描數據采集可以得到化合物的準分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質量及結構。

子離子分析（MS/MS）

子離子，用于結構判斷(得到化合物的二級譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應監(jiān)測（MRM）。子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內CID）可能十分相似，所不同的是子離子質譜圖已知只有一種質量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產生的，所以我們更相信由MS/MS產生的譜圖的純度。第59頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三用大氣壓電離質譜儀可以得到分子量信息正離子方式常出現如下離子:-Na22Da.higherthanM+H-K38Da.higherthanM+H-Li6Da.higherthanM+H-NH417Da.higherthanM+H-ACN40Da.higherthanM+H2M+H,2M+Na等負離子方式常出現如下離子:-TFA114Da.higherthenM-H(113and227background)-Acetate60Da.higherthenM-H-Formic46Da.higherthenM-H-Cl36Da.higherthanM-H第60頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三影響分子量測定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負離子方式pH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形。2）氣流和溫度：當水含量高及流量大時要相應增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當高可以提高出峰的靈敏度。4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內分解或碎裂；高DP電壓時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少7）樣品結構和性質8）雜質的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當成分復雜，雜質太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮第61頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三分子量測定中的誤判

溶劑中的雜質來自于塑料添加劑的峰樣品容器不干凈，常見表面活性劑的峰進樣系統(tǒng)污染樣品在源內碎裂，形成碎片離子第62頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三LC-MS中常見的本底離子m/z50-150,溶劑離子，[(H2O)nH+

，n=3-112]m/z102,H+乙腈

+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z149,管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z288,2mm離心管的產生的特征離子m/z279,管路中鄰苯二甲酸二丁酯

C16H22O4H+,279.1591m/z316,2mm離心管的產生的特征離子m/z384,瓶的光穩(wěn)定劑產生的離子m/z391,管路中鄰苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843m/z413,鄰苯二甲酸二辛酯+鈉,C24H38O4Na+,413.2668m/z538,乙酸+氧

+鐵（噴霧管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.8793

第63頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三分子量測定失敗的原因

a）流動相不合適b）不揮發(fā)性鹽的影響c）成分復雜，雜質太多d)樣品濃度不夠e）pH值不合適f）樣品在源內分解或碎裂第64頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三目標化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測（SIM）

SIM用于檢測已知或目標化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數據采集的方式一般用在定量目標化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質。若幾種目標化合物用同樣的數據采集方式監(jiān)測，那么可以同時測定幾種離子.第65頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三目標化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測（SIM）

SIM用于檢測已知或目標化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數據采集的方式一般用在定量目標化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質。若幾種目標化合物用同樣的數據采集方式監(jiān)測，那么可以同時測定幾種離子.第66頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三（3）母離子掃描母離子分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質量可以不同，但在分裂過程中會生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。

第67頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三(4)中性丟失掃描

中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病篩查中某些檢測項目。也可以幫助進行未知物結構判斷，例如有中性丟失18Da的意味著-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。第68頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三各種掃描方式的原理解釋：Q1FullScan(Start–Stop)(Q1全掃描)Q1alwaysusedassingleMSanalyzerUsedprimarilyforident.ofprecursorion第69頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三SIM-SelectedIonMonitoring(選擇離子監(jiān)測)UsedtooptimizeanalyzerforspecificionsSIMusedforquantitativeanalysesQ1SIMusedto“optimize”precursorionMaximizesignalinpreparationforMS/MS第70頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三ProductIonScan(子離子掃描)Afteridentification,theprecursorionissentintothecollisioncellandfragmentedbyCIDQ1isfixed,Q3sweepsagivenmassrangeUsedforstructuralelucidationFirststeptodevelopingquantitativemethodm3+scannedm1+fixed第71頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三ExampleofProductIonSpectrumEphedrine,MW=165第72頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三PrecursorIonScan(母離子掃描)Q1sweepsagivenmassrange,Q3isfixedUsedtodeterminethe“origin”ofparticularproduction(s)createdinthecollisioncellFrequentlyusedfordrugmetaboliteidentification(commonproductionobservedinthemetabolites)m3+fixedm1+scanned第73頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三ExampleofPrecursorIonSpectrum600900120015001800m/z,amu587.5745.6895.6802.4633.4520.31105.01704.4600900120015001800m/z,amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity,cps608.3520.3802.4600900120015001800m/z,amu3.0e46.0e49.0e4Intensity,cpsPrecursorsof86(Ile/Leu)Q1Scan745.6第74頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三FragmentationWhenanIonfragmentsthefollowingformulasapply:Positivemode(Parent)+

A++BNeutralNegativemode(Parent)-

A-+BNeutral第75頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三NeutralLossScan(中性丟失掃描)Q1&Q3bothscanagivenmassrangebutwithaconstantdifferencebetweenrangesscannedSpectrumindicateswhichionsloseaneutralspeciesequaltoQ1-Q3differenceComplementtoPrecursorIonScanNeutral“gain”indicatesamultiplychargedprecursorionwasfragmentedΔmm1+scannedm3+scanned第76頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三MultipleReactionMonitoring(MRM)PrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CAD)Manyprecursortoproductionpairscanbemonitored(A-B,A’-B’,etc.)MRMisthebestwaytomaximizesignalintensityofproductionsMRMusedprimarilyforquantitation第77頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三WhyLC/MS/MSforQuantitation?RetentionTime

RetentionTimeIntensityIntensityPrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CAD)IncreasedSensitivity&Specificity第78頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三儀器介紹:4000QTRAPTM四極桿-四極桿-線性離子阱串聯質譜儀是美國應用生物系統(tǒng)公司最新推出的、具有革新性設計的液相色譜-串聯質譜儀。它把四極桿-線性離子阱質譜技術首次結合在一起，既保留了串聯四極桿質譜儀的優(yōu)點如母離子掃描（PS）、中性丟失掃描（NL）、MRM定量功能，又克服了傳統(tǒng)3D離子阱質譜儀的缺點如低質量截止點（1/3效應）、“空間電荷效應”、碰撞效率低、定量性能差等。它是一臺集優(yōu)異定性功能與定量功能于一體的質譜儀，廣泛應用于蛋白質（組）研究、藥物開發(fā)、藥物代謝、有機化學、環(huán)境分析、毒物分析、食品檢驗、商品檢測、衛(wèi)生防疫、煙草品質改良等眾多領域。第79頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三q0Q1q2Q3線性離子阱：超大的離子容量：消除了傳統(tǒng)離子阱的“空間電荷效應”第80頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三低質量截止(1/3效應)低碰撞效率（離子缺失）第81頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三多電荷增強掃描功能：有效消除單電荷離子的干擾，只檢測多電荷離子，更適合檢測微量的肽或蛋白質?MS3功能：MS3功能和串聯四極桿碰撞方式，只需進行最少的實驗卻提供最充分的結構信息?動態(tài)線性范圍寬保留3Q質譜儀的優(yōu)異MRM定量性能，能夠檢測復雜基質中的微量雜質第82頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三QTRAP實現MSn功能以利血平為例:第一步做母離子609的MS2譜，由于碰撞能量較高，既有一次碰撞碎片又有多次碰撞碎片，且無1/3質量CUTOFF現象，故從低質量端到高質量端產生碎片很多。每個碎片均可做MS/MS/MS，從中確證下一級的碎片歸屬，進而推斷分子結構。例如M/Z236和M/Z195是由M/Z448產生，M/Z365和M/Z174是由M/Z397產生。M/Z365,M/Z236和M/Z195還可繼續(xù)打碎。第83頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三RESERPINE-MS/MS第84頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三RESERPINE-MS/MS/MS（448）第85頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三RESERPINE-MS/MS/MS（397）第86頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三RESERPINE-MS/MS/MS（365）第87頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三RESERPINE-MS/MS/MS（195）第88頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三LC-MS技術的應用以大氣壓電離為接口的LC-MS技術已經在藥物、化工、臨床醫(yī)學、分子生物學等許多領域中獲得廣泛的應用第89頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三具體應用領域醫(yī)藥學：藥物代謝、藥物動力學、雜質分析、天然產物分析生物化學：肽、蛋白質、寡核苷酸、糖環(huán)境化學：農藥和農殘分析、有機污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。?、血紅蛋白變異、膽酸食品科學：香料、添加物、包裝物、蛋白質、致癌物法醫(yī)學：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測獸醫(yī)學：興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學：有機金屬化合物、有機合成物有機化學：表面活性劑、染料第90頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三藥物代謝研究

藥物代謝與藥物動力學研究技術上的最新重大進展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和大氣壓化學電離（APCI）以及大氣壓光電離（APPI）是其主要的離子源，由于具有高靈敏度（ng/ml~pg/ml），高選擇性（檢測特定的碎片離子）、高效率（每天可檢測幾百個生物樣品和對藥物結構的廣泛適用性，對液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高，可通過二級離子碎片尋找原型藥物并推導其結構，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應用于藥物代謝研究中一期生物轉化反應和二期結合反應產物的鑒定、復雜生物樣品的自動化分析以及代謝物結構闡述等，已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據了主導地位，其測試的樣品量占總量的70%以上。第91頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三天然產物天然藥物的研究目前中藥開發(fā)研究有兩條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分(單體化合物)或提取物開發(fā)成新藥。另一途徑則是中藥復方制劑的開發(fā)研究。采用現代多種儀器聯用新技術，特別是高效液相色譜/質譜/質譜聯用(HPLC-MS/MS)，可對其十幾種乃至幾十種化學成分進行指紋圖譜分離鑒定。再從指紋圖譜中選擇四、五種指標成分(有效成分或特征成分)進行定量，可以確定出簡化的指紋圖譜和指標成分，又是最合理的中藥復方質量控制的方法，是研究中藥復雜體系，尤其是復方的有力工具。國內外很多學者已進行了復方丹參、清開靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。第92頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三臨床診斷和疾病生物標志物的分析

歐美等目前已廣泛采用HPLC/MS/MS法用于臨床診斷以及疾病生物標志物的研究、檢測，具有專一性好、靈敏度高、成本低、分析快速，經濟效益可觀等特點。目前可進行新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新生兒性激素變異的檢測、男女激素的監(jiān)測、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測、磷酸脂的檢測、血紅蛋白變異檢測、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過鑒定DNA損傷程度測定）、藥物劑量監(jiān)測、藥物相互作用監(jiān)測、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測等。第93頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三殘留、法醫(yī)學和環(huán)境樣品測定專家指出，中國入世后，食品工業(yè)最大的問題就是"安全壁壘"，這將給中國的進出口和國內企業(yè)帶來極大的威脅。美國食品與藥品管理局(FDA)、歐盟、日本、韓國等主要貿易國和地區(qū)公布了在進口動物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限量標準。這就要求中國加強農、畜、水產品中的農藥、獸藥等殘留的控制和檢測。同樣隨著人類對生存環(huán)境的倍加關注，要求對環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學中毒物、濫用藥物等進行更加嚴格的監(jiān)控。而配以ESI、APCI和APPI離子化技術的LC/MS/MS以分析速度快、靈敏度高、特異性好等特點廣泛應用與殘留和毒物分析。目前已成功地進行數百種農藥、獸藥、抗生素、興奮劑類殘留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺類、硝基呋喃類、毒品、多環(huán)芳烴等等化合物的檢測。第94頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三下面講解應用示例第95頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三高效液相色譜――電噴霧串聯質譜法測定清開靈復方中膽酸

采用HPLC/MS/MS技術，從清開靈注射液中，通過分子量、二級質譜碎片信息定性測定了清開靈復方中的膽酸。直接進樣實驗。清開靈注射液經過初步化學處理后采用電噴霧（ESI）離子源，在負離子掃描方式下，得到一極質譜圖、即分子離子峰[M-H]-，再用二級質譜（MS/MS）掃描目標分子離子的碎片峰。再以相同的實驗條件對標準品進行測定，做出其一級、二級質譜圖。第96頁，講稿共122頁，2023年5月2日，星期三通過對樣品進行分子離子峰的掃描發(fā)現[M-H]-的峰中有一個很強的407，根據樣