流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析

關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析第1頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三BD公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto第2頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三一流式細(xì)胞儀的基本原理

*穩(wěn)定流動(dòng)*激發(fā)光斑*熒光補(bǔ)償*熒光素選擇二數(shù)據(jù)分析及開(kāi)窗第3頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三FCM原理示意圖第4頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

層流是液體穩(wěn)定流動(dòng)的必要條件,管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)

dρVRe=<2300，

η式中ρ、η分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d和V分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCM利用層流技術(shù),使細(xì)胞流動(dòng)穩(wěn)定,并具有自聚焦作用,為細(xì)胞分析分選提供技術(shù)保證.

層流技術(shù)第5頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（示意圖）

流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

第6頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第7頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

第8頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)第9頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三.20um64um32um032um聚焦距離激光束聚焦透鏡強(qiáng)度光束成形與細(xì)胞受照方式這種橢圓形光斑的檢測(cè)區(qū)保證每個(gè)細(xì)胞分別受到光照且受檢時(shí)受到一致的光照

FCM的單細(xì)胞照明技術(shù)第10頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第11頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

第12頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三UncompensatedvsCompensatedFL1FL2

利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的方法稱“熒光補(bǔ)償”熒光補(bǔ)償?shù)?3頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光補(bǔ)償?shù)?4頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三Mean值判斷補(bǔ)償?shù)?5頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615

紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+PeCy5+APC488525、575綠色、橙色

633670

紅色

熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)（nm)發(fā)射波長(zhǎng)（nm)顏色第16頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量傳遞染料：第17頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液制備熒光抗體標(biāo)記上機(jī)檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計(jì)學(xué)分析第18頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三單分散細(xì)胞第19頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三FSCFSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小和活力相關(guān)第20頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三SSCSSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)顆粒多少相關(guān)第21頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞散色光信號(hào)第22頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞熒光測(cè)量細(xì)胞的自發(fā)熒光

未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測(cè)到有微弱的熒光信號(hào).細(xì)胞的特異性熒光

經(jīng)過(guò)各種特異染色的細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào).第23頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三自發(fā)熒光信號(hào)與特異染色的熒光信號(hào)分析圖自發(fā)熒光信號(hào)第24頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三特異染色的熒光信號(hào)第25頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三DNA分析比較第26頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三排除雙聯(lián)體細(xì)胞第27頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞阻滯在G2M期第28頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三雙克隆細(xì)胞周期分析第29頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，

BrdUrd)是胸苷的一種類似物。它可以替代胸腺嘧啶摻入到細(xì)胞新合成的DNA分子中，成為S期細(xì)胞的一種標(biāo)記物。流式細(xì)胞術(shù)采用抗BrdUrd單克隆抗體免疫熒光和PI雙參數(shù)檢測(cè)細(xì)胞，不僅可檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和DNA含量，同時(shí)可以了解不同細(xì)胞的DNA合成能力高低。

BrdUrd和DNA雙標(biāo)記染色第30頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第31頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三BrdUrd與PI檢測(cè)第32頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三BrdUrd與PI檢測(cè)第33頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三BrdUrd與PI檢測(cè)第34頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞三色熒光檢測(cè)第35頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞因子測(cè)定*檢測(cè)T細(xì)胞(CD69)活化第36頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三G6=R1*R5第37頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三*CD4抗原分子結(jié)構(gòu)引起CD4熒光強(qiáng)度下調(diào)第38頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞因子分析圖*過(guò)敏性鼻息肉與鼻息肉細(xì)胞因子比較第39頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三純化單核細(xì)胞第40頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)第41頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第42頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三G3=R1*R3G4=R1*R4第43頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三凋亡細(xì)胞測(cè)定第44頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三凋亡細(xì)胞測(cè)定第45頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞凋亡檢測(cè)第46頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三陰性的