細(xì)胞工程第9章 轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應(yīng)器

1轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應(yīng)器TransgenicAnimalsandMammaryGlandBioreactor1轉(zhuǎn)基因動物的制備方法2轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用3乳腺生物反應(yīng)器4基因打靶2轉(zhuǎn)基因動物基因工程技術(shù)胚胎工程技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）是指借助基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動物染色體內(nèi)，外源基因與動物基因整合后隨細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，在體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動物。轉(zhuǎn)基因動物3轉(zhuǎn)基因動物的命名原代轉(zhuǎn)基因動物:founderG0G1G2擬人化命名41982年,Palmiter生產(chǎn)超級小鼠

世界上第一只轉(zhuǎn)基因動物:轉(zhuǎn)入了生長激素基因的巨鼠（supermouse）

5哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要環(huán)節(jié)1目標(biāo)基因克隆和體外重組2外源基因的導(dǎo)入3外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測4轉(zhuǎn)基因動物品系或品種的建立

61轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染精子載體介導(dǎo)法胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法細(xì)胞核移植技術(shù)YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移

71.顯微注射法

操作程序如下：首先，向供體母鼠注射孕馬血清，48小時后再注射人絨毛膜促性腺激素，使其超排卵（排卵數(shù)可達(dá)25枚）。然后，將此鼠與雄鼠交配獲取受精卵，隨后將構(gòu)建的外源基因在體外用顯微注射器注射到受精卵的卵原核中。顯微注射完成后，將受精卵移植到假孕母鼠輸卵管內(nèi)，大約3周后，代孕母鼠產(chǎn)下轉(zhuǎn)基因鼠。89MicroinjectionintothePronucleus10

克隆DNA供體母鼠酶解、分離、純化、定量注射激素（PMSG，HCG）與雄鼠交配目的基因DNA片段鼠受精卵

顯微注射（卵原核中）注射DNA的受精卵輸卵管移卵假孕母鼠

表型分析胎鼠組織或幼鼠尾巴取出鼠胚胎或待娩幼鼠

制備DNA

外源基因的整合檢測

確定轉(zhuǎn)基因鼠傳代轉(zhuǎn)基因鼠顯微注射法建立轉(zhuǎn)基因鼠的一級實(shí)驗(yàn)程序？？？11顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)：

a、轉(zhuǎn)移率較高、整合效率達(dá)30%；

b、外源基因長度可達(dá)數(shù)百Kb；

c、方法相對簡單；

d、導(dǎo)入過程直觀。12缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜；隨機(jī)整合、首尾相連的多拷貝；轉(zhuǎn)基因效率較低；常造成插入位點(diǎn)附近宿主DNA大片段缺失、重組等突變，出現(xiàn)動物嚴(yán)重生理缺陷。132．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法

原理：利用攜帶外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎是最早使用的動物轉(zhuǎn)基因方法之一。其基本原理足當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄成DNA(DNA前病毒)，依靠逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶及其末端特異的核苷酸序列，DNA前病毒可整合到染色體上，從而將其所攜帶的外源基因插入到染色體上。

14逆轉(zhuǎn)錄病毒載體151617

逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：在各種轉(zhuǎn)基因方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的轉(zhuǎn)基因效率是最高的，且為單拷貝隨機(jī)整合。

缺點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在設(shè)計(jì)時雖然缺失了病毒的復(fù)制功能序列，但是復(fù)制大量載體DNA所需的輔助病毒基因組內(nèi)有可能與目的基因一起整合到同一細(xì)胞核中，就可能大量復(fù)制病毒，造成嚴(yán)重的污染，故不安全。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA（≦10kb），而且逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)的甲基化狀態(tài)常使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)缺失。181920PronuclearMicroinjectionSubzonalMicroinjection21SubzonalMicroinjection22卵周隙顯微注射示意圖(Reference:NatureProtocols,2006,1(1):288)

23慢病毒可克服以往的逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點(diǎn)—

基因沉默現(xiàn)象用慢病毒感染小鼠ES細(xì)胞，有效地將外源基因?qū)隕S細(xì)胞中，并且外源基因在ES細(xì)胞的不同分化階段得到有效地表達(dá)；將慢病毒感染的ES細(xì)胞注射到小鼠的囊胚中，移植后產(chǎn)生在眾多組織中均表達(dá)外源基因的嵌合體后代。從嵌合體獲得的胚胎也表達(dá)外源基因；用慢病毒感染胚胎得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染及外源基因有效的表達(dá)，移植后產(chǎn)生有效表達(dá)外源基因的后代。證明慢病毒可克服以往的逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點(diǎn)——

基因沉默現(xiàn)象，而成為一個制備轉(zhuǎn)基因動物的較好的工具。244、胚胎干細(xì)胞法

25ESC法是在基因組相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行同源重組或置換，而將外源DNA定向整合到內(nèi)源基因組中表達(dá)。將轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉(zhuǎn)基因動物。一般程序如下：26

獲得功能基因

構(gòu)建基因打靶載體轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞獲得基因剔除細(xì)胞系

制備嵌合體

篩選進(jìn)入生殖系小鼠

轉(zhuǎn)基因小鼠（F1）表型分析

選擇單系同胞交配產(chǎn)生（F2）代

篩選純合子的轉(zhuǎn)基因小鼠

胚胎干細(xì)胞法建立轉(zhuǎn)基因鼠的一級實(shí)驗(yàn)程序27與傳統(tǒng)育種方法相比較，ES細(xì)胞在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物方面表現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)勢：

（1）打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制，加快了動物群體遺傳變異程度；（2）可以進(jìn)行定向變異和育種，利用同源重組技術(shù)對ES細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，通過細(xì)胞核移植生產(chǎn)遺傳修飾性動物，有可能創(chuàng)造新的物種；（3）利用ES細(xì)胞技術(shù)，可在細(xì)胞水平對胚胎進(jìn)行早期選擇，這樣可以提高選擇的準(zhǔn)確性，縮短育種時間。近年來的研究表明，利用ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物在動物生產(chǎn)中發(fā)揮著極為重要的作用。2829基因打靶305、體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺3132Clonedsheephashumangene

POLLY33Korea：Productionoftransgenicclonedpigs

transgenicclonedpigswiththegreenfluorescentprotein

(GFP)onJune8,2003.342轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用（1）動物品種改良；（2）生物制藥(乳腺生物反應(yīng)器)；（3）建立人類疾病的動物模型；（4）生產(chǎn)可移植用的動物器官；（5）基因治療(動物模型)；（6）基因打靶。35（1）動物品種改良抗病育種生長性狀36（3）建立人類疾病的動物模型

已建立的部分人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型_____________________________________________疾病模型基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因______________________________________________________老年性癡呆征顯微注射β淀粉樣蛋白基因Ⅱ型糖尿病顯微注射胰島淀粉樣多肽基因β地中海貧血癥顯微注射人β珠蛋白基因鐮刀形細(xì)胞貧血癥顯微注射人α和β珠蛋白基因唐氏綜合癥顯微注射Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染HIVtat基因成骨不全癥顯微注射突變的α1膠原蛋白前體基因自毀容貌癥ES細(xì)胞同源重組突變HGPRT基因_____________________________________________374）生產(chǎn)可移植用的動物器官豬的臟器移植給人，會發(fā)生超急性排斥反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)能降低或掩蓋半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)基因豬。如何用細(xì)胞工程解決移植器官的來源問題?(2002).Science295,1089–109238（5）基因治療

上世紀(jì)九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由美國國立衛(wèi)生研究院用ADA基因治愈。“基因治療”研究熱從此波及全世界，起而效顰，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景。

3940卵周間隙顯微注射受精卵移植鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠4142（6）基因打靶基因打靶技術(shù)(Genetargeting)是一種在胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上,定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段?；蚯贸?geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代43基因打靶的研究意義基因功能研究人類疾病動物模型的研制經(jīng)濟(jì)動物遺傳物質(zhì)的改良44三個主要環(huán)節(jié)打靶載體的構(gòu)建靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選由中靶細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動物45基因打靶技術(shù)根據(jù)打靶細(xì)胞的不同，基因打靶主要分為:1胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)2體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)46胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)

首先獲得ES細(xì)胞系，利用同源重組技術(shù)獲得帶有研究者預(yù)先設(shè)計(jì)突變的中靶ES細(xì)胞。通過顯微注射將經(jīng)過遺傳修飾的ES細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)。經(jīng)過遺傳修飾的ES細(xì)胞仍然保持分化的全能性，可以發(fā)育為嵌合體動物的生殖細(xì)胞，使得經(jīng)過修飾的遺傳信息經(jīng)生殖系遺傳。47體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)家畜的體細(xì)胞克隆技術(shù)已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，為轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)提供了一條新途徑。直接在體細(xì)胞中進(jìn)行基因同源重組，體外篩選中靶細(xì)胞，再以之為核供體獲得轉(zhuǎn)基因后代，是當(dāng)前家畜基因打靶的一條有效途徑。但是，由于體細(xì)胞體外培養(yǎng)的有限性和同源重組概率低，使體細(xì)胞克隆途徑的基因打靶效率比胚胎干細(xì)胞途徑大為降低。48基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)4950基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種51正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)

(positive-negative-selection,PNS)

同源重組時，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。隨機(jī)整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內(nèi)。置換型載體含有正負(fù)選擇基因各一，正選擇基因多為neo基因，位于同源區(qū)內(nèi)，其在隨機(jī)整合和同源重組中均可正常表達(dá)。負(fù)選擇基因在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，相反在隨機(jī)整合時，所有的序列均保留（包括tk）。52

胸苷激酶蛋白（TK）可使無毒的丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账幔鴼⑺兰?xì)胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。故同源重組時，G418和GANC都有抗性，隨機(jī)整合時對G418有抗性，但對GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無整合的將被G418殺死。用G418作正篩選，選出含有neo基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥苷作負(fù)篩選淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，保留未含有tk基因的同源重組細(xì)胞株。此方法是目前應(yīng)用較廣泛的一種策略。正向篩選標(biāo)記基因Neo具有雙重作用，一方面導(dǎo)致靶基因的插入突變；同時作為重組細(xì)胞的正向篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可使細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)基中生長。53實(shí)驗(yàn)流程

542007年生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎諾貝爾獎美國猶他大學(xué)Eccles人類遺傳學(xué)研究所科學(xué)家MarioR.Capecchi、美國北卡羅來納州大學(xué)教會山分校醫(yī)學(xué)院教授OliverSmithies與英國科學(xué)家卡迪夫大學(xué)卡迪夫生命科學(xué)學(xué)院MartinJ.Evans因胚胎干細(xì)胞和基因打靶研究獲得此獎項(xiàng)。

55563乳腺生物反應(yīng)器

Mammaryglandbioreactor:

ProteinFactoryoftheFuture

1987年美國科學(xué)家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生產(chǎn)出一種醫(yī)用蛋白──tPA（組織型纖溶酶原激活物），展示了用動物乳腺生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的可能性。利用動物乳腺生產(chǎn)高價值產(chǎn)品的方式稱為動物乳腺反應(yīng)器。57轉(zhuǎn)基因山羊--活動的制藥廠

Mammaryepithelialcells58

如荷蘭的GenPharm公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，預(yù)計(jì)每年從牛奶生產(chǎn)出來營養(yǎng)奶粉的銷售額是50億美元。59動物多肽藥物用途綿羊a1抗胰蛋白酶蛋白治療氣腫綿羊CFTR治療囊腫性纖維化綿羊組織型纖溶酶原活化因子治療血栓綿羊凝血VIII因子、IX因子治療血友病綿羊纖維蛋白原傷口愈合豬組織型纖溶酶原活化因子治療血栓豬凝血VIII因子、IX因子治療血友病山羊人蛋白質(zhì)C治療血栓山羊抗血栓因子3治療血栓山羊谷氨酸脫羧酶治療I型糖尿病山羊Pro542治療愛滋病牛a-乳清白蛋白抗炎癥牛凝血VIII因子治療血友病牛纖維蛋白原傷口愈合牛膠原蛋白I,II組織修復(fù),治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎牛乳鐵蛋白治療腸道感染,感染性關(guān)節(jié)炎牛人血清白蛋白維護(hù)血液體積雞,牛,山羊單克隆抗體用于疫苗生產(chǎn)60動物乳腺生物反應(yīng)器利用哺乳動物乳腺特異性表達(dá)的啟動子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物，指導(dǎo)外源基因在乳腺中的表達(dá)，并從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中獲取重組蛋白。61表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因的選擇體外重組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)胚胎移植鑒定62優(yōu)點(diǎn)一：產(chǎn)出高產(chǎn)品活性高：一頭奶牛一年可產(chǎn)奶8000～10000升，而一只綿羊和山羊也可產(chǎn)奶800～1000升，以最低表達(dá)量1克/升的重組蛋白計(jì)算（即轉(zhuǎn)基因動物奶液中重組蛋白的含量，一般為1～20克