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肺炎衣原體抗體IgM金標(biāo)檢測(cè)試劑盒(膠體金法)作業(yè)指導(dǎo)書1目的建立肺炎衣原體抗體IgM金標(biāo)檢測(cè)試劑盒(膠體金法)作業(yè)指導(dǎo)書,確保生產(chǎn)過程處于受控狀態(tài)。2范圍適用于肺炎衣原體抗體IgM金標(biāo)檢測(cè)試劑盒(膠體金法)相關(guān)工序的操作者。3職責(zé)3.1操作人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行本作業(yè)指導(dǎo)書。3.2生產(chǎn)主管負(fù)責(zé)監(jiān)督檢查。3.3質(zhì)檢部質(zhì)檢員負(fù)責(zé)抽查執(zhí)行情況。4工作內(nèi)容4.1生產(chǎn)工藝流程圖※膠體金制備膠體金制備★膠體金反應(yīng)膜檢測(cè)膠體金標(biāo)記膠體金反應(yīng)膜檢測(cè)膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)單克隆抗體制備進(jìn)單克隆抗體制備進(jìn)★貼板產(chǎn)品檢測(cè)裝卡分包質(zhì)量檢測(cè)切貼板產(chǎn)品檢測(cè)裝卡分包質(zhì)量檢測(cè)切條NC反應(yīng)膜檢測(cè)NC膜包被★NC反應(yīng)膜檢測(cè)NC膜包被抗原檢測(cè)MOPP重組抗原的表達(dá)NC膜處理NC膜檢測(cè)※NC膜處理NC膜檢測(cè)入庫(kù)入庫(kù)抗體檢測(cè)兔抗鼠IgG抗體制備抗體檢測(cè)兔抗鼠IgG抗體制備注:※關(guān)鍵過程★特殊過程4.2作業(yè)內(nèi)容4.2.1膠體金制備(檸檬酸三鈉還原法)氯金酸(HAuCl4)水溶液放入三角瓶?jī)?nèi)加熱至沸騰→加熱檸檬酸三鈉溶液→混勻,攪拌煮沸10至15分鐘→待膠體金溶液顏色由藍(lán)→紫→紅,冷卻即可。4.2.2金標(biāo)抗體(反應(yīng)膜)制備以0.1M碳酸鉀溶液調(diào)膠體金溶液pH8.0-9.0→加入抗人IgM單抗,15分鐘后加入聚乙二醇→離心,調(diào)532nm測(cè)OD值5~10,方陣滴定法選定標(biāo)記工作濃度→用無(wú)紡布浸濕膠體金溶液,干燥、平整,檢測(cè)。4.2.3金標(biāo)抗體反應(yīng)膜質(zhì)檢將制備好的金標(biāo)抗體反應(yīng)膜按5‰比例抽檢,與標(biāo)準(zhǔn)反映膜匹配組裝成品,同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)成品作如下對(duì)照檢測(cè):a)符合率:樣品稀釋液、陰性質(zhì)控血清無(wú)假陽(yáng)性,陽(yáng)性質(zhì)控血清均呈陽(yáng)性;b)反應(yīng)強(qiáng)度:+/+++(陽(yáng)性反應(yīng)線/陰性反應(yīng)線);c)反應(yīng)時(shí)間:30s~5min。確認(rèn)合格后才能轉(zhuǎn)入下一工序。4.2.4NC反應(yīng)膜制備親和性高分子硝酸纖維素膜→活化處理12小時(shí)→用水洗5次,每次20分鐘→室溫干燥后→取純化Cpn重組MOPP抗原和兔鼠IgG抗體溶于10%CS中,濃度均為2mg/ml,用Cpn重組MOPP抗原在NC膜上包被肺炎衣原體IgM抗體陽(yáng)性檢測(cè)線→用兔抗鼠IgG抗體在NC膜上包被對(duì)照線→干燥后,用BS液封閉,H2O清洗后,室溫干燥,備用。4.2.5NC反應(yīng)膜質(zhì)檢4.2.5.1常規(guī)圖形模式檢測(cè):將制備好的反應(yīng)膜按5‰比例抽檢,與標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)抗體反映膜匹配組裝成品,同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)成品對(duì)照檢測(cè);觀察陽(yáng)性、陰性包被線及本底,要求圖形規(guī)則程度均勻,無(wú)遺漏或重復(fù)包被。4.2.5.2均一性、符合率篩選:按3%比例/批,隨機(jī)取樣,每張5~10人份,作陰性質(zhì)控品和肺衣IgM陽(yáng)性血清的陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè),無(wú)假陽(yáng)性和假陰性,均一性≥98%4.2.6反應(yīng)體系組裝組裝材料材料規(guī)格(mm)組裝方式反應(yīng)膜(S1)20見圖1無(wú)紡布(S2)25,30吸水紙(S3)30金標(biāo)反應(yīng)膜(S4)10雙面膠帶(S5)29,48塑料墊板S678單面膠帶S7154.2.6.1反應(yīng)體組裝程序:a)在S6塑料基板上貼雙面膠帶S5(29,48mm)二條;b)在S5上貼反應(yīng)膜S1(20mm),S1上下緣距S6上下緣各29mm;c)在S6上貼吸水紙S3(30mm),吸水紙下緣與S1上緣交接1mm,上緣與S5的上邊緣對(duì)齊;d)在S5下端貼無(wú)紡布S2-1,其上緣壓住S1下緣1mm;e)在S2-1上平放金標(biāo)抗體反應(yīng)膜S4(10mm)上緣對(duì)齊;f)在S4上平放無(wú)紡布S2-2(30mm)上下緣分別S4、S6對(duì)齊;g)將組裝成型的反應(yīng)體系用電腦可調(diào)式切割機(jī)切成4.2mm測(cè)試條,裝入干燥器,待包裝。4.2.6.2成品包裝:每支成品先裝聚苯乙烯塑料外殼,再用鍍鋁膜包裝加干燥劑,附說明書,打批號(hào)入庫(kù),每批留樣100人份,以備復(fù)檢.4.2.7參比品制備4.2.7.1肺衣IgM陽(yáng)性血清質(zhì)控品取臨床確診肺衣病人(臨床癥狀明顯、肺炎衣原體培養(yǎng)陽(yáng)性)血清15份,間接ELISA測(cè)定肺炎衣原體IgM抗體陽(yáng)性,0D492≥0.3,混合血清加防腐劑,分裝-70℃保存。4.2.7.2肺衣IgM陰性血清質(zhì)控品取健康人血清(體查健康,培養(yǎng)法和間接ELISA測(cè)定肺炎衣原體IgM抗體均陰性,0D492<0.10)15份,混合血清加防腐劑,分裝-70℃保存。4.3成品檢測(cè)產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《肺炎衣原體抗體IgM金標(biāo)檢測(cè)試劑盒(膠體金法)》產(chǎn)品注冊(cè)標(biāo)要求。4.3.1外觀4.3.1.1要求檢測(cè)條:表面應(yīng)平整、無(wú)劃傷、開裂、變形及污漬;檢測(cè)卡各組分附著牢固、內(nèi)容齊全;b)檢測(cè)卡:外殼應(yīng)平整,上下蓋應(yīng)均勻合攏,無(wú)明顯間隙;反應(yīng)芯試條在外殼內(nèi)應(yīng)附著牢固;4.3.1.2檢驗(yàn)在自然光線下,用手感和目力觀察方法進(jìn)行檢驗(yàn)。4.3.2符合率4.3.2.1陰性符合率4.3.2.1.1要求試劑卡測(cè)試肺炎衣原體IgM抗體陰性質(zhì)控血清10份,假陽(yáng)性判斷結(jié)果不多于1份,符合率應(yīng)≥90%。4.3.2.1.2測(cè)試a)試劑1)樣品稀釋液;2)測(cè)定樣品液:肺炎衣原體IgM抗體陰性質(zhì)控血清。b)測(cè)定方法隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡,測(cè)定陰性IgM質(zhì)控血清10份。測(cè)定時(shí)取10μl陰性IgM質(zhì)控血清加在檢測(cè)卡加樣孔中,再加100μl樣品稀釋液,平放,等待3~5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果,但不可超過20分鐘讀結(jié)果。c)結(jié)果以下結(jié)果為合格:檢測(cè)線不顯色,只有對(duì)照線顯色。4.3.2.2陽(yáng)性性符合率4.3.2.2.1要求試劑卡測(cè)試肺炎衣原體IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控血清10份,假陰性判斷結(jié)果不多于1份,符合率應(yīng)≥90%。4.3.2.2.2測(cè)試a)試劑1)樣品稀釋液;2)測(cè)定樣品液:肺炎衣原體IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控血清。b)測(cè)定方法隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡,測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)控血清10份。測(cè)定時(shí)取10μl陰性質(zhì)控血清加在檢測(cè)卡加樣孔中,再加100μl樣品稀釋液,平放,等待3~5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果,但不可超過20分鐘讀結(jié)果。c)結(jié)果以下結(jié)果為合格:檢測(cè)線和對(duì)照線均顯色。4.3.3重復(fù)性4.3.3.1陰性重復(fù)率4.3.3.1.1要求使用試劑盒檢測(cè)同一份陰性質(zhì)控血清10次,同一份質(zhì)控血清的陰性判定結(jié)果應(yīng)基本一致,假陽(yáng)性判定結(jié)果不多于1份,陰性重復(fù)率應(yīng)≥90%。4.3.3.1.2測(cè)定隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡,測(cè)定時(shí)取10μl陰性質(zhì)控血清加在檢測(cè)卡加樣孔中,再加100μl樣品稀釋液,平放,等待3~5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果,但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.3.2陽(yáng)性重復(fù)率4.3.3.2.2要求使用試劑盒檢測(cè)同一份陽(yáng)性IgM質(zhì)控血清10次,同一份質(zhì)控血清的陽(yáng)性判定結(jié)果應(yīng)基本一致,假陰性判定結(jié)果不多于1份,陰性重復(fù)率應(yīng)≥90%。4.3.3.2.2測(cè)定隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡,測(cè)定時(shí)取10μl陽(yáng)性IgM質(zhì)控血清加在檢測(cè)卡加樣孔中,再加100μl樣品稀釋液,平放,等待3~5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果,但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.4精密性4.3.4.1要求每批試劑盒隨機(jī)抽取10個(gè)檢測(cè)卡樣品,用同一份陽(yáng)性IgM質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè),要求各檢測(cè)卡的顯色應(yīng)均一。4.3.4.2測(cè)定隨機(jī)從同批待測(cè)試劑盒中抽取10個(gè)檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定時(shí)取10μl陽(yáng)性質(zhì)控血清加在檢測(cè)卡加樣孔中,再加100μl樣品稀釋液,平放,等待3~5分鐘觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果,但不可超過20分鐘讀結(jié)果。4.3.5穩(wěn)定性4.3.5.1要求a)在37C條件下加速破壞試驗(yàn)放置12天,檢測(cè)卡的
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