紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)原理及操作

關(guān)于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)原理及操作第1頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)儀器原理第2頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三g-X-射線紫外可見(jiàn)紅外微波無(wú)線電2004008003200(nm)波長(zhǎng)真空紫外近紅外核磁共振波長(zhǎng)越短，能量越高原理第3頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三1）分子吸收光譜的形成過(guò)程：運(yùn)動(dòng)的分子外層電子----吸收外來(lái)外來(lái)輻射----產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷---分子吸收譜。2）由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收

光能量的情況也就不會(huì)相同。因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長(zhǎng)處的吸光度的高低判別或測(cè)定該物質(zhì)的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎(chǔ)。3）紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)。

朗伯-比耳定律是光吸收的基本定律，俗稱光吸收定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)和基礎(chǔ)。原理第4頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三入射光I0透射光I光程長(zhǎng)b一、透射率T%

透射率

T%=II0×100%朗伯-比耳定律第5頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三

當(dāng)入射光波長(zhǎng)一定時(shí)，待測(cè)溶液的吸光度A與其濃度和液層厚度成正比，即k為比例系數(shù)，與溶液性質(zhì)、溫度和入射波長(zhǎng)有關(guān)。

當(dāng)濃度以g/L表示時(shí)，稱k為吸光系數(shù)，以a表示，即

當(dāng)濃度以mol/L表示時(shí)，稱k為摩爾吸光系數(shù)，以表示，即比a更常用。越大，表示方法的靈敏度越高。與波長(zhǎng)有關(guān)，因此，常以表示。朗伯-比耳定律第6頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)及類型第7頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三UV示意圖第8頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)儀器由光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)五部分組成。一、光源

對(duì)光源基本要求：足夠光強(qiáng)、穩(wěn)定、連續(xù)輻射且強(qiáng)度隨波長(zhǎng)變化小。1.鎢及碘鎢燈：340~1500nm，多用在可見(jiàn)光區(qū)；2.氫燈和氘燈：160~375nm，多用在紫外區(qū)。二、單色器(Monochromator)

在UV-Vis光度計(jì)中，單色器通常置于吸收池的前面（可防止強(qiáng)光照射引起吸收池中一些物質(zhì)的分解）儀器結(jié)構(gòu)第9頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、吸收池(Cell，Container)：

用于盛放樣品?？捎檬⒒虿Ａ煞N材料制作，前者適于紫外區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)；后者只適于可見(jiàn)光區(qū)。有些透明有機(jī)玻璃亦可用作吸收池。四、檢測(cè)器：

硅光電池、PMT、PDA五、數(shù)據(jù)系統(tǒng)

它的作用是放大信號(hào)并以適當(dāng)方式指示或記錄下來(lái)?，F(xiàn)在一般的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)有計(jì)算機(jī)控制和主機(jī)單片機(jī)控制兩種類型，功能基本類似。儀器結(jié)構(gòu)第10頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的類型很多，但可歸納為三種類型，即單光束分光光度計(jì)、雙光束分光光度計(jì)和比例雙光束分光光度計(jì)。1.單光束分光光度計(jì)

經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過(guò)參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測(cè)定。這種簡(jiǎn)易型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。類型第11頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三

2.雙光束分光光度計(jì)經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過(guò)參比池，一束通過(guò)樣品池。光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長(zhǎng)的函數(shù)記錄下來(lái)。

雙光束分光光度計(jì)一般都能自動(dòng)記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時(shí)分別通過(guò)參比池和樣品池，還能自動(dòng)消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。類型第12頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三

3.比例雙光束分光光度計(jì)由同一單色器發(fā)出的光被分成兩束，一束直接到達(dá)檢測(cè)器，另一束通過(guò)樣品后到達(dá)另一個(gè)檢測(cè)器。這種儀器的優(yōu)點(diǎn)是可以監(jiān)測(cè)光源變化帶來(lái)的誤差，但是并不能消除參比造成的影響類型第13頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三6擋狹縫可選PC控制存儲(chǔ)、調(diào)用方便可采用復(fù)制、拷貝方法在電子表格和字處理軟件中處理數(shù)據(jù)和打印報(bào)告可加載膜厚、動(dòng)力學(xué)、多波長(zhǎng)、色彩分析等軟件DDM（雙閃耀波長(zhǎng)雙單色器）降低雜散光，提高長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)的能量響應(yīng)（UV-2550）UV-2550的特點(diǎn)第14頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三

三、UV-Vis分光光度法的應(yīng)用及分析條件選擇第15頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、定性分析

不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同或者說(shuō)其分子能級(jí)的能量(各種能級(jí)能量總和)或能量間隔各異，因此不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長(zhǎng)或能量的外來(lái)輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)。

定性分析具體做法是讓不同波長(zhǎng)的光通過(guò)待測(cè)物，經(jīng)待測(cè)物吸收后，測(cè)量其對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，輻射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)作圖，得到該物質(zhì)的吸收光譜或吸收曲線，據(jù)吸收曲線的特性(峰強(qiáng)度、位置及數(shù)目等)研究分子結(jié)構(gòu)。應(yīng)用第16頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、定量分析1.單組份定量方法1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法2）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法該法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法的簡(jiǎn)化，即只配制一個(gè)濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)量其吸光度，求出吸收系數(shù)k，然后由Ax=kcx求出cx

該法只有在測(cè)定濃度范圍內(nèi)遵守L-B定律，且cx與cs大致相當(dāng)時(shí)，才可得到準(zhǔn)確結(jié)果。2.多組分定量方法由于吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中測(cè)定多個(gè)組份。應(yīng)用第17頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、儀器測(cè)量條件由于光源不穩(wěn)定性、讀數(shù)不準(zhǔn)等帶來(lái)的誤差。當(dāng)分析高濃度的樣品時(shí)，誤差更大。由L-B定律：微分后得：將上兩式相比，并將dT和dc分別換為T(mén)和c，得當(dāng)相對(duì)誤差c/c最小時(shí)，求得T=0.368或A=0.434。即當(dāng)A=0.434時(shí)，吸光度讀數(shù)誤差最?。⊥ǔ？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程b來(lái)控制A的讀數(shù)在0.15~1.00范圍內(nèi)。分析條件選擇第18頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、反應(yīng)條件選擇1.顯色劑的選擇原則：使配合物吸收系數(shù)最大、選擇性好、組成恒定、配合物穩(wěn)定、顯色劑吸收波長(zhǎng)與配合物吸收波長(zhǎng)相差大等。2.顯色劑用量：配位數(shù)與顯色劑用量有關(guān)；在形成逐級(jí)配合物，其用量更要嚴(yán)格控制。3.溶液酸度：配位數(shù)和水解等與pH有關(guān)。4.顯色時(shí)間、溫度、放置時(shí)間等。分析條件選擇第19頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、參比液選擇

1.溶劑參比：試樣組成簡(jiǎn)單、共存組份少（基體干擾少）、顯色劑不吸收時(shí)，直接采用溶劑（多為蒸餾水）為參比；2.試劑參比：當(dāng)顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收時(shí)，采用試劑作參比（不加待測(cè)物）；

3.試樣參比：如試樣基體在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)時(shí)，可以試樣作參比（不能加顯色劑）。分析條件選擇第20頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、干擾消除1.控制酸度：配合物穩(wěn)定性與pH有關(guān)，可以通過(guò)控制酸度提高反應(yīng)選擇性，副反應(yīng)減少，而主反應(yīng)進(jìn)行完全。如在0.5MH2SO4介質(zhì)中，雙硫腙與Hg2+生成穩(wěn)定有色配合物，而與Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等離子生成的有色物不穩(wěn)定。2.選擇掩蔽劑3.合適測(cè)量波長(zhǎng)4.干擾物分離5.導(dǎo)數(shù)光譜及雙波長(zhǎng)技術(shù)分析條件選擇第21頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的保養(yǎng)與故障處理第22頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、環(huán)境要求１、使用工作溫度：15-35℃，濕度：45-80%，如果溫度高于30℃，則濕度必須小于70%２、避免日光直射３、避免震動(dòng)４、避免強(qiáng)磁場(chǎng)，電場(chǎng)５、遠(yuǎn)離腐蝕性氣體，并避免置于任何可能導(dǎo)致紫外區(qū)吸收的含有機(jī)/無(wú)機(jī)試劑氣體的區(qū)域６、避免臟污、多塵環(huán)境保養(yǎng)第23頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、工作臺(tái)要求

１、可承受壓力35Kg+25Kg（PC）２、最小尺寸：長(zhǎng)：1120mm，寬：710mm，高：520mm三、電源要求

１、供電電壓：100/120/220/230/240V交流±5%50/60Hz２、功率消耗：約190VA３、保險(xiǎn)絲使用：100-120V供電，5A；220-240V供電，3.15A４、安裝地點(diǎn)具備可靠的儀器接地端子保養(yǎng)第24頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、清潔儀器外部和樣品室1、使用軟布稍微蘸取水，或水溶液或者中性清潔劑溶液輕柔搽拭外表面。避免蘸取過(guò)量而導(dǎo)致流入儀器內(nèi)部。2、清除樣品室內(nèi)殘留液體樣品，防止蒸發(fā)，避免腐蝕樣品室。五、波長(zhǎng)準(zhǔn)確度檢查（每半年一次）

利用氘燈的兩個(gè)特征波長(zhǎng)峰486.0nm和656.1nm來(lái)檢查波長(zhǎng)的精確度。保養(yǎng)第25頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三六、分光光度計(jì)的校正當(dāng)光度計(jì)使用一段時(shí)間后其波長(zhǎng)和吸光度將出現(xiàn)漂移，因此需要對(duì)其進(jìn)行校正。波長(zhǎng)標(biāo)度校正：

使用鐠-釹玻璃（可見(jiàn)光區(qū)）和鈥玻璃（紫外光區(qū)）進(jìn)行校正。因?yàn)槎呔衅涓髯缘奶卣魑辗?。吸光度?biāo)度校正：

采用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)液校正（在15oC時(shí)，于不同波長(zhǎng)處測(cè)定0.04000g/L的KOH溶液（0.05mol/L）的吸光度A，調(diào)整光度計(jì)使其A達(dá)到指定的吸光度。保養(yǎng)第26頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三1、光度計(jì)初始化失敗1）光度度沒(méi)電源（檢查風(fēng)扇是否轉(zhuǎn)動(dòng)），軟件沒(méi)有出現(xiàn)初始化屏幕。（光度計(jì)狀態(tài)窗口報(bào)告OFF。）2）光度計(jì)電源接通，但軟件初始化屏幕沒(méi)有出現(xiàn)，不能和光度計(jì)連接。（光度計(jì)狀態(tài)窗口處于OFF。）故障修理檢查項(xiàng)目處理方法電源線插入插座保險(xiǎn)絲更換新的檢查項(xiàng)目處理方法RS-232系列電纜UV-2401/2501PC確認(rèn)已固定好光度計(jì)和電腦上的連接器端口.選擇“Acquire(導(dǎo)入）”菜單下的“Utilities(工具）”，通過(guò)選擇“ON”鍵建立與光度計(jì)的通信。初始化屏幕出現(xiàn)。第27頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三故障修理第28頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三步驟檢查項(xiàng)目說(shuō)明1LSI初始化參數(shù)初始化2ROM檢查檢查光度計(jì)的ROM3RAM檢查

檢查隨機(jī)儲(chǔ)存器4濾光片電機(jī)初始化檢查雜散光切割濾光片位置5狹縫電機(jī)初始化檢查狹縫電機(jī)位置6光源電機(jī)初始化檢查光源電機(jī)位置7掃描電機(jī)2初始化檢查波長(zhǎng)掃描電機(jī)2位置(主單色器)8掃描電機(jī)1初始化檢查波長(zhǎng)掃描電機(jī)1位置(前單色器)9碘鎢燈位置搜索鹵素?zé)糇畲竽芰慷ㄎ?0波長(zhǎng)原點(diǎn)1搜索檢查波長(zhǎng)源位置11碘鎢燈能量搜索檢查鹵素?zé)裟芰?2氚燈最大位置搜索

氚燈最大能量定位13氚燈能量搜索檢查氚燈能量14波長(zhǎng)原點(diǎn)2搜索檢查0NM波長(zhǎng)位置15待命初始化完畢第29頁(yè)，講稿共33頁(yè)，2023年5月2日，星期三3）在初始化階段出現(xiàn)的錯(cuò)誤（紅色標(biāo)記出現(xiàn)）初始化錯(cuò)誤和相應(yīng)的處理方法初始化步驟檢查項(xiàng)目處理方法1-7（UV-2401/2450）1-8（UV-2501/2550）這些項(xiàng)目的初始化失敗需要通過(guò)島津制作所或其指定代理商來(lái)處理。8-13（UV-2401/2450）1-14（UV-2501/2550）光源：打開(kāi)光源室罩看光源是否成套。（不要直視氘燈過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間暴露在UV輻射下會(huì)對(duì)眼睛有傷害）關(guān)閉光度計(jì)和電腦，再次開(kāi)始啟動(dòng)過(guò)程。觀察燈是否亮，如果不，則此燈應(yīng)更換。碘鎢燈可使用2000小時(shí)，氘燈可使用500小時(shí)間。更換后重新啟動(dòng)。樣品室檢查是否有雜物阻擋光束。去掉雜物重新初始化。樣品室確認(rèn)樣品室門(mén)已關(guān)