純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

關(guān)于純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第1頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)一、無菌技術(shù)用于分離、轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)微生物的器具事先不含任何微生物；在分離、轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)微生物做到無菌操作在分離、轉(zhuǎn)接、純種培養(yǎng)過程中為保持純種的“純潔”性而防止被其它微生物污染的技術(shù)。 第2頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三高溫干熱滅菌高壓蒸汽滅菌試管、瓶子、培養(yǎng)皿等常用的滅菌方法：1、微生物培養(yǎng)的常用器具及接種室的滅菌（1）常用的器具：第3頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三紫外線殺菌效率與照射強(qiáng)度和時(shí)間的成積成正比化學(xué)消毒劑熏蒸滅菌霉菌較多先用5%石碳酸噴灑，再用甲醛熏蒸細(xì)菌較多乳酸和甲醛交替熏蒸超凈工作臺(tái)的滅菌 （2）接種室的空氣滅菌第4頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2、接種操作無菌操作：培養(yǎng)基經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后，用無菌工具在無菌條件下將含菌材料移接于培養(yǎng)基的這一過程。火焰附近（酒精燈、煤氣燈）進(jìn)行第5頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三無菌操作：在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下進(jìn)行第6頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三微生物的純種分離：從多種混雜的微生物中，經(jīng)某種技術(shù)或方法獲得單一菌株的過程。微生物的純培養(yǎng)物（pureculture)：一株菌種或一個(gè)培養(yǎng)物中的所有細(xì)胞或孢子都是由一個(gè)細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代

二、微生物的分離純培養(yǎng)技術(shù)第7頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三純種分離的原理和方法第8頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1.用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)法原理：使微生物稀釋后在固體培養(yǎng)基平板上形成單個(gè)菌落方法：稀釋倒平板法涂布平板法平板劃線法厭氧微生物的固體平板分離法 第9頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1、稀釋倒平板法2、涂布平板法對(duì)好氧菌、熱敏感菌效果不好！使用較多的常規(guī)方法，但有時(shí)涂布不均勻！第10頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三3、平板劃線法方法：平行劃線法之字形劃線法

第12頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三4、厭氧微生物的分離厭氧罐厭氧手套箱對(duì)嚴(yán)格厭氧微生物的培養(yǎng)采用稀釋搖管法進(jìn)行分離第14頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三個(gè)別細(xì)胞較大細(xì)菌固體平板不能長菌落原生動(dòng)物、藻類接種物用液體培養(yǎng)基順序梯度稀釋法分離:

2、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 第15頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序梯度稀釋，使每一稀釋度都含有很多平行試管，如果同一個(gè)稀釋度的大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）平行試管中沒有微生物生長，有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。 第16頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三3、單細(xì)胞（孢子）分離法一般采用顯微操作儀，在顯微鏡下進(jìn)行；操作難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比；解剖顯微鏡下用吸管挑選單細(xì)胞（孢子） 第17頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三4、選擇培養(yǎng)分離法抑制大多數(shù)其它非目的微生物；使待分離的目的微生物成為優(yōu)勢菌；原理：創(chuàng)造適于目的微生物生長條件；第18頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三方法：1、利用選擇培養(yǎng)基直接分離目的微生物2.富集培養(yǎng)第19頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1、利用選擇培養(yǎng)基直接分離目的微生物抑制性選擇培養(yǎng)基（selectivemedium）:根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)δ郴瘜W(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)，只允許特定微生物生長，而同時(shí)抑制或阻止其它微生物生長的培養(yǎng)基。

第20頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三例一：從土壤中分離篩選蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌 第21頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三含牛奶選擇培養(yǎng)基目的菌的平板第22頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三例二：從土壤中分離篩選產(chǎn)高溫淀粉酶（65℃）細(xì)菌 第23頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2.富集培養(yǎng)從自然界中分離到所需的特定微生物特定的條件使目的微生物旺盛生長待分離微生物在群體中成為優(yōu)勢菌第24頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三富集培養(yǎng)是分離微生物菌種最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。根據(jù)微生物的特殊要求，從自然界分離出各類特異的微生物；例：從土壤中分離能降解利用對(duì)羥基苯甲酸的細(xì)菌 第25頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三5、二元培養(yǎng)物培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識(shí)的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。病毒和宿主細(xì)胞；第26頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三菌落（colony）：

單個(gè)（或一團(tuán)相同）微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體眾多菌落連成一片菌苔（lawn）第二節(jié)微生物觀察技術(shù)1.微生物群體肉眼觀察第27頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征（形狀、顏色等），可以成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類、鑒定的重要依據(jù)。第28頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第29頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三同一細(xì)菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落第30頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2、顯微鏡個(gè)體觀察技術(shù)放大倍數(shù)分辨率反差能辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力被觀察物區(qū)別于背景的程度一、顯微技術(shù)：用顯微鏡進(jìn)行觀察的技術(shù)顯微鏡的自身特點(diǎn)有關(guān)也取決于顯微觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的正確使用良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)評(píng)價(jià)顯微鏡性能的指標(biāo)第31頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三二、光學(xué)顯微鏡的種類及原理1.普通光學(xué)顯微鏡第32頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三光學(xué)顯微鏡的一般配置如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最佳觀察效果？目鏡：10~15╳；物鏡：100╳；總放大倍數(shù)1000~1500╳；第33頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三l分辨率（最小可分辨距離）=————

2nsinqλ：可見光波長n：玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率θ：物鏡鏡口角的半數(shù)nsinθ：物鏡的數(shù)值口徑值 第34頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三提高普通光學(xué)顯微鏡分辨率的技術(shù)措施：

使用波長較短的可見光（450nm的藍(lán)光）；使用油浸物鏡增大反差（色差）的技術(shù)措施：

對(duì)微生物細(xì)胞或特殊結(jié)構(gòu)染色 第35頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2、特殊的光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡暗視野顯微鏡熒光顯微鏡 第36頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三相差顯微鏡的原理：當(dāng)光線通過透明的活細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)各部分結(jié)構(gòu)密度的差異（或折射率的不同)，而使光波的相位發(fā)生變化，形成相位差，但人的眼睛分辨不出相位差異，相差顯微鏡就是根據(jù)光波干涉利用特殊的環(huán)狀光闌和相差板將相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?，從而使原來透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對(duì)比度增強(qiáng)。用途：活細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況和微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察第37頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三暗視野顯微鏡原理：聚光系統(tǒng)加以改造，實(shí)現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光不直接穿過物鏡，而是由樣品反射或折射后在進(jìn)入物鏡，所以樣品是一個(gè)暗背景下顯現(xiàn)亮的物象。暗視野顯微鏡的分辨率很高熒光顯微鏡的原理：在紫外線的照射下，發(fā)熒光的物體會(huì)在黑暗的背景下表現(xiàn)為光亮的有色物體第38頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三光學(xué)顯微鏡的特性第40頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三二、電子顯微鏡的種類及原理1、透射電鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM） 電磁波作“光源”高速電子透射樣品，電子束通過電磁場產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)、匯集或發(fā)散等復(fù)雜的螺旋式運(yùn)動(dòng)，聚集成像，用熒光屏或感光膠片做記錄。電磁波波長短，分辨率高：光學(xué)顯微鏡μm級(jí)，電鏡nm級(jí)。

第41頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三2、掃描電鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）

電子束做電子探針在樣品表面掃描時(shí)激發(fā)出二次電子，二次電子產(chǎn)生的多少與樣品表面立體形貌有關(guān)。對(duì)二次電子處理，在熒光屏呈現(xiàn)放大樣品表面立體圖像。 第42頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三3、掃描隧道顯微鏡原理：當(dāng)金屬探針可以接觸到樣品表面的電子云時(shí)，在探針和樣品之間加零點(diǎn)幾伏的電壓將有隧道電流產(chǎn)生，該電流對(duì)針尖及樣品間的距離非常敏感，保持探針掃描樣品時(shí)的電壓和高度恒定，通過記錄電壓或電流的變化了解樣品的表面形貌。4、原子力顯微鏡用激光裝置監(jiān)測探針隨樣品表面的升降變化來獲取樣品表面形貌的信息第44頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第45頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三三、顯微觀察樣品的制備 （1）光學(xué)顯微鏡制樣有活體直接觀察和染色觀察懸滴法活體觀察壓