生物膜的保護(hù)劑海藻糖在凍干紅細(xì)胞中的應(yīng)用

生物膜的保護(hù)劑海藻糖在凍干紅細(xì)胞中的應(yīng)用生物膜的保護(hù)劑海藻糖在凍干紅細(xì)胞中的應(yīng)用【摘要】 海藻糖作為一種穩(wěn)定的非還原性雙糖~在細(xì)胞冷凍、干燥、凍干過程中對(duì)細(xì)胞活性有著良好的保護(hù)作用并已廣泛應(yīng)用于人血細(xì)胞的凍干。海藻糖以其異常的水合能力、獨(dú)特的玻璃化轉(zhuǎn)換和晶體轉(zhuǎn)變行為及抗高溫潮濕的特性受到密切關(guān)注~并成為細(xì)胞保存研究中首選的一種保護(hù)劑。海藻糖對(duì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制、海藻糖導(dǎo)入哺乳細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法以及紅細(xì)胞對(duì)海藻糖負(fù)載的可能作用機(jī)制都是近幾年細(xì)胞保存研究的熱點(diǎn)~本文就以上幾方面的進(jìn)展詳細(xì)進(jìn)行論述。【關(guān)鍵詞】 生物膜保護(hù)劑，海藻糖，凍干保存，紅細(xì)胞Trehalose—ABiomembraneProtectantApplyiedtoLyophilizationofHumanRedBloodCells——ReviewAbstractTrehalose,asanonreducingdisaccharide,playsaroleinprotectingthecytoactivitywhenthecellsisfreezing,dryingorlyophilization.Ithasbeenabiomembraneprotectantappliedtolyophilizationofhumanbloodcells(plateletsanderythrocytes), and fromwhichastonishingresultshavebeenobtained.Havingpowerfulhydration,distinctivevitrificationtransformandcrystaltransformanduniqueresistanceofhightemperatureandhumidification,trehaloseisthoughtofapreferredprotectantinthestudyofcellpreservation.Inrecentyears,peopleconcernedtrehaloseonitsprotectivemechanism,experimentalmeansoftransittrehalosetomammalcellsandthemechanismofloadinginredbloodcells.Theaboveaspectswerebrieflysummarizedinthisarticle.Keywordstrehalose, vitrification, lyophilization, erythocyte海藻糖作為一種穩(wěn)定的非還原性雙糖?在一些微生物、低濕休眠脊椎動(dòng)物和更蘇植物中有較高的濃度。當(dāng)這些生物處于干燥脫水或高滲環(huán)境時(shí)?海藻糖可以在細(xì)胞膜外形成一種玻璃狀的防護(hù)層?提高了細(xì)胞的滲透壓耐受性或耐干燥性?從而在干燥狀態(tài)下保護(hù)生物體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類、糖類、核酸等組分不受破壞?使細(xì)胞繼續(xù)保持活性,1,。鑒于海藻糖對(duì)低等生物細(xì)胞具有這種特殊的保護(hù)作用?人們開始嘗試探索海藻糖是否對(duì)高級(jí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞也有類似的作用?研究發(fā)現(xiàn)海藻糖對(duì)一些體細(xì)胞?如胰島內(nèi)分泌細(xì)胞,2,和成纖維細(xì)胞,3?4,都有不同程度的保護(hù)作用。近幾年?人們將海藻糖應(yīng)用于人類血細(xì)胞的冷凍保存或凍干保存中。Pellerin-Mendes等,5,在采用不同濃度的海藻糖冷凍保存紅細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)?紅細(xì)胞在1mol/L海藻糖溶液中深低溫保存后細(xì)胞回收率達(dá)到81,?上清液游離血紅蛋白的濃度僅為0.4g/L?和傳統(tǒng)的甘油冷凍法獲得的結(jié)果無明顯差異。Wolkers等,6,已經(jīng)成功地將海藻糖導(dǎo)入人血小板的胞質(zhì)內(nèi)?其機(jī)制可能是溫度介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示?負(fù)載海藻糖的血小板經(jīng)凍干后?其存活率大約為90,?復(fù)水后存活的血小板功能全都恢復(fù)?且已用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。海藻糖的獨(dú)特性質(zhì)很多學(xué)者在比較了海藻糖與其他一些小分子量糖類之后?發(fā)現(xiàn)海藻糖具有其特有的物理和化學(xué)性質(zhì)?而正是這些特有的性質(zhì)使其具有特有的保護(hù)作用。海藻糖的異常水合能力Kawaai等,7,的研究表明?在已研究的二糖中?海藻糖周圍的不凍水分子數(shù)最大?如果以每個(gè)葡萄糖單位周圍的不凍水分子數(shù)計(jì)算?海藻糖的不凍水分子是糖類最多的。Magazu等,8,比較了海藻糖/水和蔗糖/水在玻璃化相轉(zhuǎn)變附近的振動(dòng)性質(zhì)?認(rèn)為海藻糖/水具有更剛性的結(jié)構(gòu)?也就是說?它能把細(xì)胞包封在一種更剛性的結(jié)構(gòu)中?因此海藻糖抗冷凍脫水的能力更強(qiáng)。海藻糖異常的玻璃化轉(zhuǎn)變及晶型轉(zhuǎn)變行為近幾年來,玻璃化及玻璃化轉(zhuǎn)變理論逐漸應(yīng)用于凍干過程的研究。玻璃化是一種避免冰晶形成的低溫保護(hù)方法?無冰晶固態(tài)結(jié)構(gòu)的玻璃態(tài)?由于黏度大?流動(dòng)性差?能阻礙分子擴(kuò)散和冰晶形成?因而可防止一些化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。因此形成玻璃態(tài)不僅可以防止冰晶的產(chǎn)生，還可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。溶液的玻璃化相變溫度（1的高可使樣本在干燥時(shí)及以后的保存中有更高的穩(wěn)定性,9,。海藻糖的Tg是120??比其他雙糖體系的相變溫度要高得多。任何濃度的海藻糖溶液都比其糖類有更高的玻璃化相變溫度?此外高濃度的海藻糖溶液比其他糖類更不容易形成冰晶。Sussich等,10,認(rèn)為?細(xì)菌在失水時(shí)獲得的休眠狀態(tài)不僅是因?yàn)楹Ｔ逄禽^高的Tg導(dǎo)致的黏度增加?而且與水分失去時(shí)的晶型分子排列的變化有關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)了一種無水晶態(tài)海藻糖分子。這種晶態(tài)的化合物具有獨(dú)特的可逆性吸收水分?轉(zhuǎn)化成二水化合物?而不改變主要結(jié)構(gòu)特性的作用。這種可逆的過程在海藻糖對(duì)生物細(xì)胞抗脫水能力的保護(hù)上起了非常重要的作用。海藻糖抗高溫潮濕的作用Leslie等，11,報(bào)道?在有海藻糖存在的條件下凍干后的細(xì)菌具有高度的存活率。他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)?用海藻糖作為凍干保護(hù)劑時(shí)?將凍干樣品,細(xì)菌,長(zhǎng)時(shí)間暴露在潮濕的空氣中?細(xì)菌仍保持了高度活性。Esteves等，12，在最近的實(shí)驗(yàn)中指出?在進(jìn)行免疫交聯(lián)物的凍干過程中?海藻糖和其他雙糖均表現(xiàn)出不同程度的保護(hù)作用。但若將凍干樣品保存在相對(duì)潮濕的高溫條件下?用海藻糖作為凍干保護(hù)劑的凍干樣品比其他樣品更加穩(wěn)定。這一結(jié)果對(duì)在較惡劣的條件下保存和運(yùn)輸免疫交聯(lián)物、疫苗、抗血清等產(chǎn)品的有著重要意義。在理想的干燥和保存條件下?海藻糖也并不是唯一最佳的保護(hù)劑。相關(guān)研究表明?聯(lián)合應(yīng)用多聚體和其他小分子量糖類?對(duì)細(xì)胞也會(huì)起到相似的1保護(hù)作用，13?14,?在某些保存條件下?甚至?xí)鸬礁玫男Ч?。但在較差的環(huán)境中?海藻糖卻能夠比其他糖類更好地維持細(xì)胞的穩(wěn)定性。所以?海藻糖作為一種細(xì)胞保存研究中首選的保護(hù)劑仍然受到密切的關(guān)注。海藻糖對(duì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制海藻糖對(duì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制一直是眾多研究的熱點(diǎn)?目前主要有以下兩種觀點(diǎn)。水替代學(xué)說生物體中的蛋白質(zhì)、糖、脂肪和其他大分子物質(zhì)均被一層水膜保護(hù)著。在干燥過程中?水分逐漸消失?導(dǎo)致這些大分子物質(zhì)發(fā)生不可逆的變化?如蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)的變化。Crowe等，15，認(rèn)為?當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)水失去時(shí)?海藻糖可在失水部位以羥基和分子形成氫鍵?這使得分子在缺水條件下仍能保持其原有結(jié)構(gòu)?而不喪失活性。脫水過程中?海藻糖一方面能和磷脂形成氫鍵?抑止膜泡聚合?另一方面在高溫下能有效降低膜相變溫度?防止再水化時(shí)發(fā)生吸水破壞。玻璃態(tài)學(xué)說大多數(shù)的研究者都認(rèn)為海藻糖的玻璃化狀態(tài)在長(zhǎng)時(shí)間保存細(xì)胞活性中發(fā)揮了重要作用。生物細(xì)胞的玻璃化狀態(tài)被認(rèn)為是細(xì)胞脫水過程中膜保護(hù)的機(jī)制之一?玻璃化既可以發(fā)生在室溫條件下,干燥,?也可以發(fā)生在零度以下，降溫冷凍，。在這兩種情況下?只要溶液粘滯度升高到，1014Pa/s,溶液濃度增加或溫度降低均可造成溶液粘滯度的升高,就會(huì)出現(xiàn)溶液的玻璃化態(tài)。玻璃化狀態(tài)何以能保護(hù)細(xì)胞膜,這是由于:?玻璃化抑止降溫時(shí)冰晶的形成?避免了深低溫保存時(shí)細(xì)胞受到的冰晶傷害和由于局部離子濃度過高而造成的化學(xué)傷害,?在胞膜可以發(fā)生損害性相變的溫度和水合條件下?保護(hù)液的玻璃化則可以降低解鏈溫度,Tm,?盡可能地保持胞膜的流動(dòng)狀態(tài)。在凍干脂質(zhì)體的研究中?當(dāng)有海藻糖的存在時(shí)?脂質(zhì)體的Tm在干燥狀態(tài)時(shí)降低到一20??從而使脂質(zhì)在干燥狀態(tài)下仍能保持液晶態(tài)?再水化過程中也不出現(xiàn)脂質(zhì)的相位轉(zhuǎn)化。細(xì)胞負(fù)載海藻糖方法研究在早期的凍干研究中?冷凍之前細(xì)胞在含有葡萄糖的緩沖液中進(jìn)行孵育。除此之外?在細(xì)胞外加入一種多聚體,羥乙基淀粉或者葡聚糖,來提高溶液的玻璃化溫度,Tg,。這種混合使用低分子量糖和有較高Tg的多聚體在體外干燥保存脂質(zhì)體取得了很好的效果,16,?但在凍干保存紅細(xì)胞時(shí)?羥乙基淀粉或葡聚糖對(duì)細(xì)胞的穩(wěn)定作用會(huì)降低?這可能是因?yàn)槎嗑垠w的體積較大?很困難使其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部所致。使用二糖作為凍干保護(hù)劑面對(duì)的主要問題是如何解決質(zhì)膜對(duì)這些糖類的非滲透性?而使其在胞內(nèi)達(dá)到足夠高的濃度來發(fā)揮作用。凍干人紅細(xì)胞的第一步?應(yīng)該是實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的負(fù)荷。對(duì)一個(gè)成功的凍干紅細(xì)胞的方案?將海藻糖導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)是關(guān)鍵的一步。國(guó)外將海藻糖導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)研究方法如下。?Oliver等,17,和Wolkers等,6?18,利用細(xì)胞內(nèi)吞作用在不同的實(shí)驗(yàn)中分別將海藻糖導(dǎo)入人的間質(zhì)干細(xì)胞和血小板。？Beattie等,2,利用胞膜在磷脂相轉(zhuǎn)變過程中的易滲性成功地將海藻糖導(dǎo)入胰島細(xì)胞。作者指出?二甲亞砜可能作為一種弱的表面活性劑在膜的相變過程中大大增加海藻糖的滲透性。？Eroglu等，19,和Chen等,4,利用轉(zhuǎn)基因的a-溶血素金黃色葡萄糖球菌?一種打孔蛋白?在哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞膜上產(chǎn)生跨膜孔形成可逆性的透化處理。通過這種方法?作者發(fā)現(xiàn)海藻糖可以改善幾種人類細(xì)胞系對(duì)冷凍和干燥處理的耐受性。？Guo等,20，和Puhlev等,21，通過基因表達(dá)編碼人類包皮纖維母細(xì)胞的6-磷酸海藻糖合酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶?從而增加此種細(xì)胞干燥耐受性。同樣的?另一種轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株?可使胞內(nèi)海藻糖濃度達(dá)到80mmol/L?也使其滲透脆性得到改善。？Katkov等，22,和Shirakashi等,23,在其他的海藻糖負(fù)荷研究中?對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞施行電打孔術(shù)。盡管海藻糖可較容易的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?但打孔后的細(xì)胞常常滲透脆性增加?不適合進(jìn)一步凍干保存。？Satpathy等,24,在最近的研究中采用了一種有效的?溫和的方法將海藻糖導(dǎo)入人紅細(xì)胞。這種方法基于紅細(xì)胞胞膜的熱性質(zhì)并提供紅細(xì)胞對(duì)海藻糖在37?足夠的吸收時(shí)間，7小時(shí)，。數(shù)據(jù)表明?通過細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不平衡和磷脂相變的聯(lián)合作用可使胞內(nèi)海藻糖濃度達(dá)到50mmol/L。紅細(xì)胞負(fù)載海藻糖可能的作用機(jī)制紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的負(fù)荷明顯依賴于胞外海藻糖溶液的濃度。細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓不平衡能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)海藻糖的攝取?隨著胞外海藻糖濃度的增加?胞內(nèi)海藻糖量也增加。紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的攝取未發(fā)現(xiàn)有飽和依賴性。與之不同的是?人血小板對(duì)海藻糖的攝取有濃度依賴性。Wolkers等，18,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：37?孵育?胞外海藻糖濃度在0-35mmol/L時(shí)?血小板對(duì)海藻糖的吸收率成直線上升。當(dāng)胞外海藻糖濃度達(dá)到75mmol/L時(shí)?海藻糖的攝取率反而下降?負(fù)荷血小板對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)能力下降。小分子物質(zhì)如葡萄糖、赤藻糖醇、乙烯二醇、甘油等可通過易化擴(kuò)散通過紅細(xì)胞胞膜?而尿素、硫脲等物質(zhì)通過被動(dòng)擴(kuò)散完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)?其濃度梯度作為主要推動(dòng)力。Satpathy等,24,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)胞外海藻糖濃度低于600mmol/L時(shí)?紅細(xì)胞對(duì)海藻糖沒有明顯的攝取。這說明其攝取機(jī)制可能并不是易化擴(kuò)散?因?yàn)橐谆瘮U(kuò)散可以在很低的胞外介質(zhì)濃度時(shí)發(fā)生。但當(dāng)胞外海藻糖濃度大于600mmol/L時(shí)?紅細(xì)胞對(duì)其的攝取開始增加?似乎又表明海藻糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能量有部分是來源于細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差?增加細(xì)胞內(nèi)外海藻糖的濃度梯度看來是海藻糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中首先出現(xiàn)的推動(dòng)力。由阿利紐斯作圖法,Arrheniusplot,計(jì)算所得的轉(zhuǎn)運(yùn)海藻糖所需的活化能是16.05十1.5kcal/mol。Weith等,25，報(bào)道?赤藻糖醇經(jīng)易化擴(kuò)散通過人紅細(xì)胞胞膜時(shí)?需要的活化能為21.5千0.7kcal/mol。當(dāng)胞外海藻糖濃度固定，且足夠高,時(shí)?紅細(xì)胞在4?和37?孵育條件下?胞內(nèi)海藻糖量是不同的?有理由認(rèn)為:海藻糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)不單是經(jīng)易化擴(kuò)散?而是伴有膜脂的向溫性換位。紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的攝取明顯依賴于孵育溫度?而后者能影響紅細(xì)胞胞膜的流動(dòng)性。4?條件下?紅細(xì)胞對(duì)海藻糖的攝取率很低?37?時(shí)?攝取率明顯增加?這個(gè)結(jié)果同溫度降低引起紅細(xì)胞膜磷脂有序性升高的現(xiàn)象是一致的。紅細(xì)胞膜在14?時(shí)由于膜磷脂的“溶解”?出現(xiàn)相變的低協(xié)同效應(yīng)?另一個(gè)協(xié)同效應(yīng)出現(xiàn)在34??由富含膽固醇和神經(jīng)鞘磷脂區(qū)域的“溶解”所引起。紅細(xì)胞對(duì)海藻糖最大的攝取量,胞內(nèi)海藻糖濃度大約為55mmol/L,發(fā)生在37??此時(shí)的紅細(xì)胞膜磷脂處于液晶態(tài),26,?這個(gè)溫度略高于使神經(jīng)鞘磷脂微區(qū)解鏈或“漂移”的溫度，34?,,27,。Satpathy等，24,推測(cè)“漂移”效應(yīng)可能參與了37?時(shí)紅細(xì)胞膜對(duì)海藻糖的轉(zhuǎn)運(yùn)?導(dǎo)致了此溫度條件下胞膜對(duì)海藻糖的較高攝取量。苯甲醇實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了海藻糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與紅細(xì)胞胞膜的物理性質(zhì)有關(guān)。如果海藻糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)由脂質(zhì)相變所介導(dǎo)?那么細(xì)胞膜的液化劑將增加低溫下的海藻糖的攝取。苯甲醇是一種膜液化劑?分隔紅細(xì)胞膜引起胞膜相變溫度降低。Satpathy等,24,在實(shí)驗(yàn)中?將紅細(xì)胞谿于800mmol/L的海藻糖溶液中于4?孵育22小時(shí)?從而使胞內(nèi)海藻糖濃度明顯增加。增加胞膜流動(dòng)性可提高胞內(nèi)海藻糖濃度表明?改變細(xì)胞膜的物理狀態(tài)在海藻糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮一定的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1NewmanYM,RingSG,ColacoC.Theroleoftrehaloseandothercarbohydratesinbiopreservation.BiotechnolGenetEngRev,1993;11:263-2942BeattieGM,CroweJH,LopezAD,etal.Tehalose:acryprotectantthatenhancesrecoveryandpreservesfunctionofhumanpancreaticisletsafterlong-termstorage.Diabetes,1997,46:519-5233Garcia-de-CastroA,TunnacliffeA.Intracellulartrehaloseimprovesosmotolerancebutnotdesiccationtoleranceinmammaliancells.FEBSLetters,2000,487:199-2024ChenT,AckerJP,ErogluA,etal.Beneficialeffectofintracellulartrehaloseonthemembraneintegrityofdriedmammaliancells.Cryobiology,2001,43:168-1815Pellerin-MendesC,MillionL,Marchand-ArvierM,etal.Invitrostudyoftheprotectiveeffectoftrehaloseanddextranduringfree-zingofhumanredbloodcellsinliquidnitrogen.Cryobiology,1997,35:173-186WolkersWF,WalkerNJ,TabinF,etal.Humanplateletsloadedwithtrehalosesurvivefreeze-drying.Cryobiology,2001,43:79-87KawaiH,SakuraiM,InoueY,etal.Hydrationofoligosaccharides:anomaioushydrationabilityoftrehalose.Cryobiology,1992,29:599-606MagazuS,BrancaC,FaraoneA,etal.Comparisonofdisacchaidesolutionacrossglasstransition.PhysicaB,2001,301:126周俊,劉景漢.血小板凍干保存的研究進(jìn)展.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志?2004;12:542-545SussichF,SkopecC,BradyJ,etal.Reversibledehydrationoftrehaloseandanhydrobiosis:fromsolutionstatetoanexoticcrytal?.CarbohydrateResearch,2001,334:165-176LeslieSB,IsraeliE,LighthartB,etal.Trehaloseandsucroseprotectbothmembranesandproteinsinintactbacteriaduringdrying.ApplEnvironMicrobiol?1995,61:3592—3597EstevesMI,QuintilioW,SatoRA,etal.Stabilisationofimmunoconjugatesbytrehalose.BiotechnolLett?2000,22:417—420CroweJH,OliverAE,HoekstraFA,etal.Stabilizationofdrymembranesbymixturesofhydroxyethylstarchandglucose:theroleofvitrification.Cryobiology,1997,35:20—30HinchaDK,HellwegeEM,MeyerAG,etal.Plantfructansstabilizephosphatidylcholineliposomesduringfreeze-drying.EurJBiochem?2000,267:535-540CroweJH.Anhydrobiosis:anunsolvedproblem.AmericanNaturalist,1971,105:563-573CroweJH,OliverAE,HoekstraFA,etal.Stabilizationofdrymembranesbymixturesofhydroxyethylstarchandglucose:theroleofvitrification.Cryobiology,1997,35:20-30Oliver,JamilK,CroweJH,etal.LoadingMSCswithtrehalosebyendocytosis.CellPreservationTechnol,2004;2:35-44WolkersWF,LooperSA,FontanillaRA,etal.Temperaturedependenceoffluidphaseendocytosiscoincideswithmembranepropertiesofpigplatelets.BiochimBiophysActa,2003,1612:154-16319ErogluA,RussoMJ,BiaganskiR,etal.Intracellulartrehaloseimprovesthesurvivalofcryopreservedmammaliancells.NatBiotechnol,2000,:163-16720GuoN,PuhlevI,BrownDR,etal.Trehaloseexpressionconfersdesiccationtoleranceonhumancells,NatBiotechnol,20