色譜的定性與定量

關(guān)于色譜的定性與定量第1頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、色譜的定性分析1、利用保留值定性

鑒別每個色譜峰通過比較保留值(通常是保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時間來定性 即所謂：保留時間相同，可能是同樣的組份保留時間不同，肯定不是同樣的組份第2頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（1）氣相色譜中用保留值定性的方法

①利用已知物直接對照進行定性分析通常做法：把未知物和已知標準物在同一根色譜柱上，用相同的色譜操作條件進行分析，記錄色譜圖后利用保留時間進行比對為避免載氣流速和溫度變化引起保留時間的變化，可用相對保留值定性或用已知物增加峰高法定性第3頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

已知物增加峰高法定性原理：在得到未知樣品的色譜圖后，往未知樣品中加入一定量的已知物質(zhì)，在同樣色譜條件下的兩色譜圖對比圖譜比較峰高。第4頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三②利用相對保留值定性

定義：相對保留值是組分i與基準物S的調(diào)整保留值之比：

優(yōu)點：可以消除某些操作條件的影響，只要柱溫、固定相不變，即使柱徑、柱長、填充情況及流動相的流速有所變化，相對保留值γ仍然不變，它是色譜定性分析的重要參數(shù)第5頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三③利用保留指數(shù)定性

表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上所公認的定性參數(shù)，它具有定性可靠，重現(xiàn)性好，標準統(tǒng)一等優(yōu)點。

可將儲存在計算機中的標準保留指數(shù)轉(zhuǎn)換成用戶色譜條件下的保留指數(shù)和保留時間（tR）第6頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（A）定義（B）保留指數(shù)的測定保留指數(shù)的準確度和重現(xiàn)性都很好，用同一色譜柱測定誤差小于1%，因此只要柱溫和固定液相同，就可以用文獻上發(fā)表的保留指數(shù)定性。第7頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（2）液相色譜中用保留值定性的方法

保留值定性的主要方法

★直接與已知標準物對照★某一未知峰和已知標準物的保留值完全相同—可能是★改變色譜柱或流動相，保留時間仍完全相同—基本是第8頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三利用文獻的數(shù)據(jù)進行對比和定性分析

注意HPLC的柱填充技術(shù)的復(fù)雜性，定性受到限制第9頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

最簡單的方法：標準添加法

前提：要有標準物

判斷的標準：加入標準樣后，使未知樣色譜峰增高，改變色譜條件，未知峰仍能增高第10頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三同時用其他方法其他色譜方法（改變機理，如：用不同的色譜柱）其他檢測器PDA，光譜圖比較、譜庫檢索確認色譜峰的純度

-保證每個色譜峰下只有一個被測的組份

-檢查是否有共流出的物質(zhì)（雜質(zhì)）干擾色譜峰純度確認的方法

-用光電二極管矩陣檢測器比較光譜圖

-峰純度鑒定，四波長比例MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫檢索其他儀器方法第11頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（3）平面色譜中用保留值定性的方法

定性方法：比較未知組分和已知標準物質(zhì)的比移值影響比移值的因素：固定相的性質(zhì)、展開劑的性質(zhì)、被分離組分的性質(zhì)、展開時的溫度等注意事項①展開槽應(yīng)密閉②沿分離軌跡固定相與流動相無梯度變化③展開劑的前沿位置能正確測定第12頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2.聯(lián)機定性

聯(lián)機定性是指把色譜和質(zhì)譜、紅外、紫外和核磁共振法聯(lián)合使用聯(lián)用方式：第一種：先收集色譜分離后的組分，再用“四大譜”的方法進行定性分析第二種：通過“接口”技術(shù)直接把色譜和“四大譜”儀器連接起來，對每一被分離的組分進行定性分析第13頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、色譜定量分析定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測定檢測限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標樣建立標準曲線檢查方法的準確度及精確度用標樣定期檢查方法第14頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（一）定量分析基礎(chǔ)1.定量分析的基本公式定量分析的目的：

要確定樣品中某一組分的準確含量，是一種相對的定量方法

定量分析的方法：

在某些限定條件下，檢測器響應(yīng)值（色譜峰的峰面積或峰高）---所測組分的數(shù)量或濃度成正比，第15頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三即：

式中：–組分i的質(zhì)量

—組分i的濃度

—組分的校正因子（與檢測器的性質(zhì)和被測組分的性質(zhì)有關(guān)）

—組分i的峰面積，

—組分i的峰高第16頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2.峰面積的準確測定1）對稱峰的峰高和峰面積的測定第一法：峰高×半高峰寬式中：h—從峰頂?shù)椒宓拙€的垂直距離

Wh/2—峰高1/2處的峰寬第17頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第二法：三角形法式中：BM—三角形的高

Wi—三角形KML的半高寬，近似等于色譜峰高0.607處的峰寬第18頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2)不對稱峰峰高和峰面積的測量第一法：峰高×峰寬的平均值式中：h—峰頂?shù)椒宓拙€的垂直距離

?（b0.15+b0.85)—峰高0.15處和峰高0.85處的峰寬平均值第19頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第二法：峰分割計算后加和法

A=A1+A2=h1×b1+h2×b2第三法：大峰上的小峰峰面積的測量第四法：基線漂移時色譜峰峰面積的測量第五法：重疊峰峰面積的測量第20頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三3.定量校正因子的測定（1）絕對校正因子（fi)★fi的物理意義:單位峰面積所代表的I組分的量,是一個與i組分的物理化學(xué)性質(zhì)和檢測器的性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)★定量校正因子的計算公式為：注意:峰高定量校正因子fi(h)受操作條件影響較大

第21頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

絕對校正因子fi的大小主要由操作條件和儀器的靈敏度所決定，既不容易準確測量，也無統(tǒng)一標準；當(dāng)操作條件波動時，fi也發(fā)生變化。故fi無法直接應(yīng)用，定量分析時，一般采用相對校正因子。第22頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（2）相對校正因子（校正因子）：式中：f--相對校正因子，簡稱為校正因子，無因次量

fi,fs—i物質(zhì)、基準物質(zhì)（s）的質(zhì)量（或濃度)Ai(hi),As(hs)---物質(zhì)、基準物質(zhì)的峰面積（或峰高）第23頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

根據(jù)物質(zhì)量的不同表示方法，校正因子分為：①質(zhì)量校正因子(fm)

定義：當(dāng)物質(zhì)量用質(zhì)量來表示時的校正因子稱為質(zhì)量校正因子(fm),表示單位峰面積所代表的組分質(zhì)量，質(zhì)量一般用g或mg表示.

式中：mi,ms-被測物質(zhì)、基準物質(zhì)的質(zhì)量

Ai,As-被測物質(zhì)、基準物質(zhì)的峰面積

第24頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三②摩爾校正因子(fM)

定義：物質(zhì)的量用摩爾數(shù)表示，表示單位峰面積所代表的組分摩爾數(shù)

式中：Mi,Ms-被測物質(zhì)、基準物質(zhì)的摩爾質(zhì)量第25頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三③體積校正因子（fv）定義：物質(zhì)的量用體積表示,表示單位峰面積所代表的組分體積。

式中：Vi,Vs—表示被測物質(zhì)、基準物質(zhì)的體積第26頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三(3)相對響應(yīng)值sˊ

相對響應(yīng)值是物質(zhì)i與標準物質(zhì)S的響應(yīng)值（靈敏度）之比。單位相同時，與校正因子互為倒數(shù)，即：與只與試樣、標準物質(zhì)以及檢測器類型有關(guān)，而與操作條件和柱溫、載氣流速、固定液性質(zhì)等無關(guān)，是一個能通用的常數(shù)。

第27頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（4）校正因子的實驗測量方法

★樣品的準備：測定校正因子時，要精密稱定適量色譜純的被測組分和基準物質(zhì)，配制成已知準確濃度的樣品。★樣品的測定：在已確定的色譜條件下，取準確體積的樣品進樣，從譜圖上獲得準確的峰面積

★計算：根據(jù)相對校正因子的計算公式可以算出質(zhì)量（或摩爾或體積）校正因子第28頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例：某試樣合有5μg乙醇，測得相應(yīng)的色譜峰面積為150mm2，求乙醇的fi。解：即每平方毫米色譜峰面積代表3.3×10-2μg乙醇第29頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例：準確稱取一定質(zhì)量的色譜純對二甲苯、甲苯、苯及仲丁醇，混合后稀釋，采用氫焰檢測器，定量進樣并測量各物質(zhì)所對應(yīng)的峰面積，數(shù)據(jù)如下：物質(zhì)苯仲丁醇甲苯對二甲苯

m/μg0.47200.63250.81490.4547A/cm22.603.404.102.20以仲丁醇為標準，計算各物質(zhì)的相對質(zhì)量校正因子。第30頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第31頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（二）定量方法1.歸一化法

★定義：把所有出峰的組分含量之和按100%計的定量方法稱為歸一化法，是一種相對定量方法?！锴疤幔簶悠分械乃薪M分都能流出色譜柱，而且在檢測器上所有的組分都能產(chǎn)生信號。計算方法：

第32頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三★優(yōu)點：歸一化法很直觀，容易接受，計算簡便、準確，當(dāng)操作條件如進樣量、流速等發(fā)生變化時，對計算結(jié)果的影響很小，是一種常用的計算方法★缺點：校正因子的測定比較麻煩，必需所有組分都出峰★注意：▼主要用于GC的定量測定，當(dāng)fi相近時，可直接用峰面積歸一化法。▼由于檢測技術(shù)的影響,HPLC中很少使用歸一化

第33頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2、內(nèi)標法內(nèi)標法：選擇適宜的物質(zhì)作為待測組分的參比物，定量加到樣品中去，根據(jù)待測組分和參比物在檢測器上的響應(yīng)值之比和參比物加入量進行定量分析的方法。第34頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三鍵：選擇合適的內(nèi)標物內(nèi)標物的選擇原則：A、內(nèi)標物必須是原樣品中不存在的物質(zhì)，其性質(zhì)盡量與待測組分相近(同系物、異構(gòu)體)B、內(nèi)標物不能和被測組分起化學(xué)反應(yīng)，要能完全溶于被測樣品中；C、內(nèi)標物的峰盡可能接近待測組分的峰，或位于幾個待測組分的中間，但必須和樣品中的所有峰完全分離；D、內(nèi)標物的加入量應(yīng)和待測組分相近。第35頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

待測組分(i)的量mi為：設(shè)樣品的總量為m，則待測組分i的質(zhì)量分數(shù)為第36頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三內(nèi)標法的特點：★無歸一化法的限制，即只要被測組分能出峰，不和其他峰重疊，不管其他組分是否出峰或是否重疊，都可以用內(nèi)標法進行定量分析★定量準確，受操作條件影響較小

★可部分補償待測組分在樣品前處理時的損失★若加入幾種內(nèi)標物，還可提高定量分析的精度★內(nèi)標物的選擇比較困難，同時內(nèi)標物稱量要求準確，操作麻煩第37頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三內(nèi)標標準曲線法

如果每次稱取同樣量(m)的試樣，每次加入相等量(ms)的內(nèi)標物，則上式中m，ms，fi’均為常數(shù)，計算公式可寫為：從內(nèi)標公式可知第38頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三實際色譜圖第40頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例:取二甲苯生產(chǎn)母液1500mg，母液中合有乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯及溶劑和少量苯甲酸，其中苯甲酸不能出峰。以150mg壬烷作內(nèi)標物，測得有關(guān)數(shù)據(jù)如下：物質(zhì)壬烷乙苯對二甲苯間二甲苯鄰二甲苯Ai/cm298709512080f`m1.020.971.000.960.98求:各組分的含量。第41頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三解：母液中苯甲酸不能出峰，所以只能用內(nèi)標法計算。由各組分的絕對校正因子計算得壬烷、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的相對校正因子分別為1.00，0.95，0.98，0.94，0.96。根據(jù)內(nèi)標法計算公式，對于乙苯有：同樣可以計算出對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的質(zhì)量分數(shù)分別為9.5%，11.5%，7.84%。第42頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三3、外標法

外標法又可分為標準曲線法和外標一點法，是色譜定量分析中比較常用的一種方法，是絕對定量方法。第43頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三計算方法：用濃度～峰面積（峰高）繪制標準工作曲線，其斜率即為絕對校正因子，應(yīng)該是一條通過原點的直線。

第44頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三特點：★簡便、快速、適合于大量樣品的分析★無需各組份都被檢出、洗脫★需要標樣★標樣及樣品測定的條件要一致★進樣體積要準確，重復(fù)性好★對樣品前處理過程中待測組分的變化無法補償。第45頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三外標一點法

利用待測組分純物質(zhì)配制一個與待測組分含量相近的標準樣（設(shè)量為ms），在同一色譜條件下，分別將相同量的待測組分標樣及試樣注入色譜儀，出峰后，測量其峰面積（或峰高），得相應(yīng)的峰面積As和Ai

第46頁，講稿共51