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文檔簡(jiǎn)介

細(xì)胞系的生命期原代培養(yǎng)

Primaryculture原代培養(yǎng)Primaryculture概念

從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)到

第一次進(jìn)行傳代之前的時(shí)期

一個(gè)特征性的必然的生長(zhǎng)階段。

完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的

過(guò)渡和適應(yīng)過(guò)程,

恢復(fù)了分裂增殖與

生長(zhǎng)發(fā)育的能力含義:包含

)①原代培養(yǎng)實(shí)質(zhì)是初次培養(yǎng),即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿

中就不再分割,任其生長(zhǎng)繁殖

②原代培養(yǎng)中的“代”

并不是指細(xì)胞繁殖的“代”數(shù)

③原代培養(yǎng)過(guò)程中不分割培養(yǎng)物

不等于不更換培養(yǎng)液建立方法:

組織塊法,分散(細(xì)胞懸液)法時(shí)間:一般~4周

(代:細(xì)胞自接種至新培養(yǎng)皿中至其下一次再接種傳代的時(shí)間為細(xì)胞的一代)特點(diǎn)(1)性質(zhì)

①性狀似體內(nèi)

可表達(dá)某些形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能,更能

代表活體細(xì)胞最接近在體時(shí)的情況

②細(xì)胞異質(zhì)性

細(xì)胞成分混雜,除目的細(xì)胞之外,

其它各種細(xì)胞還存在

③細(xì)胞活躍移動(dòng),分裂不旺盛

④相互依賴(lài)性強(qiáng)

獨(dú)立生存能力差,不易單個(gè)培養(yǎng)特點(diǎn)(2)發(fā)展過(guò)程:調(diào)整組成

原代培養(yǎng)的產(chǎn)生--選擇

結(jié)果:形成相對(duì)均一的細(xì)胞系選擇第一步:形成原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)

組織塊:能遷移出的

消化分散:操作中能生存、附著

能懸浮生存

特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程選擇第二步:

時(shí)間:數(shù)小時(shí)后至鋪滿(mǎn)

(匯合confluence)

變化:數(shù)小時(shí)后至進(jìn)一步選擇中

3種情況:能增殖

能存活

不能存活

細(xì)胞類(lèi)型,繼續(xù)改變,至鋪滿(mǎn)

(鋪滿(mǎn):貼附生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)達(dá)到一定數(shù)

量彼此連接成單層長(zhǎng)滿(mǎn)器皿底壁)特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程選擇第三步:

時(shí)間:鋪滿(mǎn)(匯合confluence)后

(可用于生長(zhǎng)區(qū)域已被利用)

變化:通過(guò)密度抑制

密度抑制敏感的細(xì)胞(如正常細(xì)胞)

密度抑制敏感低的細(xì)胞(如永生性細(xì)胞)

特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程需及時(shí)傳代

傳不傳代及何時(shí)傳代

根據(jù):

接種的細(xì)胞數(shù)量

培養(yǎng)瓶皿的大小

培養(yǎng)條件

在一定程度上具有可人為操作的特征

傳代期--細(xì)胞系

Subculture--Cellline

傳代期--細(xì)胞系Cellline概述

將原代培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)分割,重新接種

到兩個(gè)或兩個(gè)以上的器皿內(nèi)進(jìn)

行培養(yǎng),進(jìn)入傳代培養(yǎng)期

整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的主要時(shí)期

原代培養(yǎng)物----要經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代

傳代培養(yǎng)期

并不單指原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代

后的“第一代”培養(yǎng)過(guò)程

而是指由首次傳代開(kāi)始經(jīng)

反復(fù)傳代一直到培養(yǎng)物

開(kāi)始衰退之前的全部時(shí)間

傳代:細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖一段時(shí)間,到達(dá)一定細(xì)胞密度后,就應(yīng)將細(xì)胞分離成二或

幾部份至新的培養(yǎng)器皿并更新補(bǔ)充培養(yǎng)液,使之繼續(xù)繁殖生長(zhǎng),即傳代。經(jīng)過(guò)傳代即稱(chēng)為細(xì)胞系

細(xì)胞系可以繼續(xù)傳代傳代培養(yǎng)期就是

維持細(xì)胞系增殖、生長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程傳代培養(yǎng)期的長(zhǎng)短:

培養(yǎng)的細(xì)胞種類(lèi)

供體年齡大小一般是有限細(xì)胞系特點(diǎn)

細(xì)胞分裂增殖活動(dòng)旺盛,細(xì)胞生長(zhǎng)活躍

細(xì)胞群體在調(diào)整:每次傳代,調(diào)整-

因增殖能力、耐受力差異

增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞漸處于優(yōu)勢(shì)

其它逐漸淘汰

傳代培養(yǎng)早期,細(xì)胞尚能保持二倍體核型

隨著傳代次數(shù)增加

細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的概率增大

能維持的代數(shù)

一般是有限細(xì)胞系

種族(主要):成纖維細(xì)胞

人,50;

猴,40;

雞,37;鼠,8

部位:人:胚肺50±10;

腎8~19

猴:肺5;

腎20;

耳40

條件:如表皮細(xì)胞+EGF

從50代

增加至150

年齡

傳代的頻率

原則上

貼壁生長(zhǎng)將長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)罪皿的生長(zhǎng)面(器皿的底壁)

懸浮培養(yǎng)下細(xì)胞密度足夠大

具體時(shí)間并沒(méi)有定時(shí),

根據(jù)具體情況,但提前或過(guò)晚(尤以后者)都不合適

一般:數(shù)天~一周

因素:

接種細(xì)胞數(shù)量:量大-快

接種細(xì)胞性質(zhì):細(xì)胞系比原代-快

培養(yǎng)液:高血清-快意義

生物學(xué)意義:形成較均一的細(xì)胞

實(shí)際意義:

優(yōu)點(diǎn):可傳代,有特征,數(shù)目多,均一性,

可凍存

缺點(diǎn):遺傳學(xué)可改變,失去分化衰退期Senescencephase衰退期Senescencephase

概述仍生存,但基本不增殖-衰退,死亡

傳代培養(yǎng)到一定的代數(shù)時(shí),

細(xì)胞的生命活動(dòng)明顯減弱。

細(xì)胞雖然生存,但生長(zhǎng)緩慢、

很少分裂增殖甚或不再分裂,

即使及時(shí)換液也無(wú)效

表明培養(yǎng)物已經(jīng)進(jìn)入衰退期,

再向前發(fā)展,只有退化、死亡

特點(diǎn):細(xì)胞系的生命期--歸宿

有限細(xì)胞系:

一般

衰退、死亡

轉(zhuǎn)化:永生化:

--連續(xù)細(xì)胞系

自發(fā)性轉(zhuǎn)化

誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

永生化端粒端粒

在真核細(xì)胞染色體兩端功能:保護(hù)染色體的穩(wěn)定性和完整性以維持DNA完整復(fù)制

生理情況下---細(xì)胞分裂---

染色體端粒丟失---至一定程度---

DNA復(fù)制不進(jìn)行---停止分裂

∴正常細(xì)胞---增殖潛能有限---

若干代分裂后---有限細(xì)胞系瑞拉酶

端粒的長(zhǎng)短

腫瘤細(xì)胞與正常體細(xì)胞不同,

瑞粒不隨分裂

-變短

保證此特殊-機(jī)制-

端粒酶端粒酶可催化、合成并維持瑞粒一定的長(zhǎng)度

其激活可使細(xì)胞-無(wú)限增殖能力腫瘤細(xì)胞:端粒酶活性高

端粒長(zhǎng)

無(wú)限增殖自發(fā)性轉(zhuǎn)化:偶而,個(gè)別通過(guò)危機(jī)--轉(zhuǎn)化

培養(yǎng)的細(xì)胞,由于尚不明確的原因---

使培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生自發(fā)的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化細(xì)胞的性狀可傳遞給予代細(xì)胞

來(lái)源細(xì)胞:2種可能

轉(zhuǎn)化因素:種族來(lái)源

正常細(xì)胞:人0;

雞0;

鼠較易

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誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

誘導(dǎo)因素:化學(xué)、幅射、病毒等

誘發(fā)培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化因素凡能改變DNA(基因)結(jié)構(gòu)的因素

都可能成為誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化因素。如

①化學(xué)因素:如MNNG(甲基硝基亞硝基胍)

②物理因素:射線(xiàn),包括放射性核素等.

③病毒:SV40,逆轉(zhuǎn)錄病毒等.

④癌基因:衰退期不同于每一代培養(yǎng)細(xì)胞的停滯期

處于衰退期的細(xì)胞以任何方法都不能阻止

其向死亡方向發(fā)展。

可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)暗的顆粒樣結(jié)構(gòu)及空泡狀結(jié)構(gòu)

胞質(zhì)突起回縮,有時(shí)可脫落

轉(zhuǎn)化細(xì)胞主要特點(diǎn)

獲得無(wú)限傳代性(即永生化)

生長(zhǎng)速率加快

無(wú)序的生長(zhǎng)形式

貼壁能力降低接觸抑制喪失--平板克隆(集落)形成密度抑制降低對(duì)培養(yǎng)基血清依賴(lài)性減少

錨著依賴(lài)性的丟失和可在軟瓊脂中形成集落(克隆)

細(xì)胞克隆:指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂增生而來(lái)的

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