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文檔簡(jiǎn)介
細(xì)胞系的生命期原代培養(yǎng)
Primaryculture原代培養(yǎng)Primaryculture概念
從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)到
第一次進(jìn)行傳代之前的時(shí)期
一個(gè)特征性的必然的生長(zhǎng)階段。
完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的
過(guò)渡和適應(yīng)過(guò)程,
恢復(fù)了分裂增殖與
生長(zhǎng)發(fā)育的能力含義:包含
)①原代培養(yǎng)實(shí)質(zhì)是初次培養(yǎng),即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿
中就不再分割,任其生長(zhǎng)繁殖
②原代培養(yǎng)中的“代”
并不是指細(xì)胞繁殖的“代”數(shù)
③原代培養(yǎng)過(guò)程中不分割培養(yǎng)物
不等于不更換培養(yǎng)液建立方法:
組織塊法,分散(細(xì)胞懸液)法時(shí)間:一般~4周
(代:細(xì)胞自接種至新培養(yǎng)皿中至其下一次再接種傳代的時(shí)間為細(xì)胞的一代)特點(diǎn)(1)性質(zhì)
①性狀似體內(nèi)
可表達(dá)某些形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能,更能
代表活體細(xì)胞最接近在體時(shí)的情況
②細(xì)胞異質(zhì)性
細(xì)胞成分混雜,除目的細(xì)胞之外,
其它各種細(xì)胞還存在
③細(xì)胞活躍移動(dòng),分裂不旺盛
④相互依賴(lài)性強(qiáng)
獨(dú)立生存能力差,不易單個(gè)培養(yǎng)特點(diǎn)(2)發(fā)展過(guò)程:調(diào)整組成
原代培養(yǎng)的產(chǎn)生--選擇
結(jié)果:形成相對(duì)均一的細(xì)胞系選擇第一步:形成原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)
組織塊:能遷移出的
消化分散:操作中能生存、附著
能懸浮生存
特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程選擇第二步:
時(shí)間:數(shù)小時(shí)后至鋪滿(mǎn)
(匯合confluence)
變化:數(shù)小時(shí)后至進(jìn)一步選擇中
3種情況:能增殖
能存活
不能存活
細(xì)胞類(lèi)型,繼續(xù)改變,至鋪滿(mǎn)
(鋪滿(mǎn):貼附生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)達(dá)到一定數(shù)
量彼此連接成單層長(zhǎng)滿(mǎn)器皿底壁)特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程選擇第三步:
時(shí)間:鋪滿(mǎn)(匯合confluence)后
(可用于生長(zhǎng)區(qū)域已被利用)
變化:通過(guò)密度抑制
密度抑制敏感的細(xì)胞(如正常細(xì)胞)
密度抑制敏感低的細(xì)胞(如永生性細(xì)胞)
特點(diǎn)-發(fā)展過(guò)程需及時(shí)傳代
傳不傳代及何時(shí)傳代
根據(jù):
接種的細(xì)胞數(shù)量
培養(yǎng)瓶皿的大小
培養(yǎng)條件
在一定程度上具有可人為操作的特征
傳代期--細(xì)胞系
Subculture--Cellline
傳代期--細(xì)胞系Cellline概述
將原代培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)分割,重新接種
到兩個(gè)或兩個(gè)以上的器皿內(nèi)進(jìn)
行培養(yǎng),進(jìn)入傳代培養(yǎng)期
整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的主要時(shí)期
原代培養(yǎng)物----要經(jīng)過(guò)反復(fù)傳代
傳代培養(yǎng)期
并不單指原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代
后的“第一代”培養(yǎng)過(guò)程
而是指由首次傳代開(kāi)始經(jīng)
反復(fù)傳代一直到培養(yǎng)物
開(kāi)始衰退之前的全部時(shí)間
傳代:細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖一段時(shí)間,到達(dá)一定細(xì)胞密度后,就應(yīng)將細(xì)胞分離成二或
幾部份至新的培養(yǎng)器皿并更新補(bǔ)充培養(yǎng)液,使之繼續(xù)繁殖生長(zhǎng),即傳代。經(jīng)過(guò)傳代即稱(chēng)為細(xì)胞系
細(xì)胞系可以繼續(xù)傳代傳代培養(yǎng)期就是
維持細(xì)胞系增殖、生長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程傳代培養(yǎng)期的長(zhǎng)短:
培養(yǎng)的細(xì)胞種類(lèi)
供體年齡大小一般是有限細(xì)胞系特點(diǎn)
細(xì)胞分裂增殖活動(dòng)旺盛,細(xì)胞生長(zhǎng)活躍
細(xì)胞群體在調(diào)整:每次傳代,調(diào)整-
因增殖能力、耐受力差異
增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞漸處于優(yōu)勢(shì)
其它逐漸淘汰
傳代培養(yǎng)早期,細(xì)胞尚能保持二倍體核型
隨著傳代次數(shù)增加
細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的概率增大
能維持的代數(shù)
一般是有限細(xì)胞系
種族(主要):成纖維細(xì)胞
人,50;
猴,40;
雞,37;鼠,8
部位:人:胚肺50±10;
腎8~19
猴:肺5;
腎20;
耳40
條件:如表皮細(xì)胞+EGF
從50代
增加至150
年齡
傳代的頻率
原則上
貼壁生長(zhǎng)將長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)罪皿的生長(zhǎng)面(器皿的底壁)
懸浮培養(yǎng)下細(xì)胞密度足夠大
具體時(shí)間并沒(méi)有定時(shí),
根據(jù)具體情況,但提前或過(guò)晚(尤以后者)都不合適
一般:數(shù)天~一周
因素:
接種細(xì)胞數(shù)量:量大-快
接種細(xì)胞性質(zhì):細(xì)胞系比原代-快
培養(yǎng)液:高血清-快意義
生物學(xué)意義:形成較均一的細(xì)胞
實(shí)際意義:
優(yōu)點(diǎn):可傳代,有特征,數(shù)目多,均一性,
可凍存
缺點(diǎn):遺傳學(xué)可改變,失去分化衰退期Senescencephase衰退期Senescencephase
概述仍生存,但基本不增殖-衰退,死亡
傳代培養(yǎng)到一定的代數(shù)時(shí),
細(xì)胞的生命活動(dòng)明顯減弱。
細(xì)胞雖然生存,但生長(zhǎng)緩慢、
很少分裂增殖甚或不再分裂,
即使及時(shí)換液也無(wú)效
表明培養(yǎng)物已經(jīng)進(jìn)入衰退期,
再向前發(fā)展,只有退化、死亡
特點(diǎn):細(xì)胞系的生命期--歸宿
有限細(xì)胞系:
一般
衰退、死亡
轉(zhuǎn)化:永生化:
--連續(xù)細(xì)胞系
自發(fā)性轉(zhuǎn)化
誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化
永生化端粒端粒
在真核細(xì)胞染色體兩端功能:保護(hù)染色體的穩(wěn)定性和完整性以維持DNA完整復(fù)制
生理情況下---細(xì)胞分裂---
染色體端粒丟失---至一定程度---
DNA復(fù)制不進(jìn)行---停止分裂
∴正常細(xì)胞---增殖潛能有限---
若干代分裂后---有限細(xì)胞系瑞拉酶
端粒的長(zhǎng)短
腫瘤細(xì)胞與正常體細(xì)胞不同,
瑞粒不隨分裂
-變短
保證此特殊-機(jī)制-
端粒酶端粒酶可催化、合成并維持瑞粒一定的長(zhǎng)度
其激活可使細(xì)胞-無(wú)限增殖能力腫瘤細(xì)胞:端粒酶活性高
端粒長(zhǎng)
無(wú)限增殖自發(fā)性轉(zhuǎn)化:偶而,個(gè)別通過(guò)危機(jī)--轉(zhuǎn)化
培養(yǎng)的細(xì)胞,由于尚不明確的原因---
使培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生自發(fā)的轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)化細(xì)胞的性狀可傳遞給予代細(xì)胞
來(lái)源細(xì)胞:2種可能
轉(zhuǎn)化因素:種族來(lái)源
正常細(xì)胞:人0;
雞0;
鼠較易
9/11
誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化
誘導(dǎo)因素:化學(xué)、幅射、病毒等
誘發(fā)培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化因素凡能改變DNA(基因)結(jié)構(gòu)的因素
都可能成為誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化因素。如
①化學(xué)因素:如MNNG(甲基硝基亞硝基胍)
②物理因素:射線(xiàn),包括放射性核素等.
③病毒:SV40,逆轉(zhuǎn)錄病毒等.
④癌基因:衰退期不同于每一代培養(yǎng)細(xì)胞的停滯期
處于衰退期的細(xì)胞以任何方法都不能阻止
其向死亡方向發(fā)展。
可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)暗的顆粒樣結(jié)構(gòu)及空泡狀結(jié)構(gòu)
胞質(zhì)突起回縮,有時(shí)可脫落
轉(zhuǎn)化細(xì)胞主要特點(diǎn)
獲得無(wú)限傳代性(即永生化)
生長(zhǎng)速率加快
無(wú)序的生長(zhǎng)形式
貼壁能力降低接觸抑制喪失--平板克隆(集落)形成密度抑制降低對(duì)培養(yǎng)基血清依賴(lài)性減少
錨著依賴(lài)性的丟失和可在軟瓊脂中形成集落(克隆)
細(xì)胞克隆:指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂增生而來(lái)的
一
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