分子生物學基因重組和基因工程

分子生物學基因重組和基因工程第1頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA克隆、測序與重組技術的歷史1973年，StanleyCohen等人首次獲得體外重組DNA的分子克隆1977年，AllanMaxam和WalterGilbert的化學裂解DNA測序問世不久，Sanger等的雙脫氧測序法20世紀90年代啟動人類基因組計劃(humangenomeproject，HGP)重組DNA技術學(RecombinantDNATechnology)第2頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第3頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月自然界不同物種或個體之間的基因重組和基因轉移是經(jīng)常發(fā)生的，它是基因變異和物種演變、進化的基礎?；蜣D移和重組也在繁殖、病毒感染、基因表達及癌基因激活等過程中起重要作用人類進行基因克隆、動物克隆以及基因治療等科學實驗和實踐中所進行的基因操作也離不開基因轉移和重組。重組DNA技術就是基于人們對自然界的基因轉移和重組的認識發(fā)展起來的。第4頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月基因重組（Genere-arrangement，recombination）是指整段DNA在細胞內(nèi)或細胞間、甚至在不同物種之間進行交換，井能在新的位置上復制、轉錄和翻譯。是自然界常見的現(xiàn)象，基因重組有病毒介導的基因轉移，細胞在增殖、分裂、分化過程也發(fā)生基因重組或重排（rearrangement）基因重組有多種方式。第5頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA重組接合作用

(conjugation)轉化作用

(transformation)轉導作用

(transduction)轉

座

(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)第6頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。一、同源重組是最基本的DNA重組方式第7頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月同源重組需要一些重組蛋白和酶。如RecA、B、C、D及DNA連接酶等。同源重組不依賴特異DNA序列，而依賴兩分子之間的相同或相似性。若轉化或轉導獲得的外源DNA與宿主DNA同源,那么外源DNA就可以整合進宿主的染色體。第8頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Holliday模型的4個關鍵步驟：

兩個同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：第9頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月片段重組體

（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組

體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。

第10頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)第11頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體第12頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′第13頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體②①①②5′3′5′5′5′3′3′3′第14頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月二、接合作用（conjugation）當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用。細菌的基因轉移與重組方式第15頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月可接合質粒如F因子(Ffactor)細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質粒第16頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月有的細菌染色體外有一比較大的質粒-F因子(Ffactor)，是一個小型環(huán)狀雙鏈DNA。F因子中含有性鞭毛蛋白編碼基因，這決定性鞭毛的形成。有F因子的細菌有性鞭毛。當F+和F-的細菌相互接觸的時候，它們之間通過鞭毛的連接構成通道，F(xiàn)+細菌中雙連DNA的一條鏈打開一個缺口，進入另一個細菌，F(xiàn)+細菌按滾環(huán)復制另一條鏈；進入F-細菌的那條連做模板，復制成兩條鏈，這樣兩個細菌都成為F+細菌。質?！毦旧w外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子第17頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月三、轉化作用(transformation)定義：通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化。第18頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

肺炎雙球菌存在無夾膜不致病的無毒型（RH型）和有夾膜的致病型的肺炎雙球菌（SH型）。提取致病型肺炎雙球菌的DNA，加入到RH型菌里培養(yǎng)，RH型就會轉化成致病的SH型肺炎雙球菌轉化實驗：第19頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月四、轉導作用(transduction)當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一細胞（受體）時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用。第20頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)噬菌體感染細菌時，其外殼留在細菌的表面，噬菌體DNA進入大腸桿菌細胞內(nèi)，在細菌細胞內(nèi)其生活途徑有兩種：第21頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑

(lysogenicpathway)第22頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1、溶菌生長途徑(lysispathway)λDNA在細菌內(nèi)復制，也可以表達產(chǎn)生噬菌體的外殼蛋白，然后包裝成新的λ噬菌體，當生成大量的λ噬菌體后，細胞溶解，

噬菌體就釋放出來了。第23頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。第24頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)

λDNA進入細菌后，可以通過基因重組整合到細菌染色體DNA中，維持下去，隨著細菌的分裂繁殖，λDNA被擴增，當在一定條件下，這一段λDNA可以被切下來擴增、復制，進入溶菌途徑。如果λDNA切下時帶有了細菌的DNA,包裝成噬菌體后，新的噬菌體DNA就帶有細菌DNA,當其再感染另外的一個細菌時，通過溶源途徑，就將原細菌的DNA，帶給了新的細菌，這就是轉導作用。第25頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月目錄第26頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月五、位點特異重組，即特異位點間發(fā)生的整合位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。第27頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合第28頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）細菌的特異位點重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變。第29頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。第30頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變第31頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC第32頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段第33頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉酯反應單鏈切開轉移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程第34頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月六、轉座(transposition)由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括插入序列和轉座子。

第35頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

插入序列(insertionsequences,IS)組成：（一）插入序列轉座二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列：

9－41bp,位于兩側特有的正向重復序列：4－12bp，位于反向重復序列外側，為插入序列所特有。一個轉座酶（transposase)編碼基因：產(chǎn)物是轉座酶，引起轉座，位于中間長750－1500bp正向重復序列正向重復序列IRTransposaseGeneIR其組成為：第36頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月插入序列發(fā)生轉座的形式：1、保守性轉座(conservativetransposition)：2、復制性轉座(duplicativetransposition)：從原位遷至新位插入序列復制后，一個復制本遷到新位，另一個保留在原位。第37頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月轉座子Transposon末端反向重復序列TerminalrepeatsTargetDNATransposasemakesstaggeredcutsinthetargetsiteTransposaseGene1、保守性轉座錯位開切轉座子第38頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月轉座子TransposonThetransposonisinsterdatthesiteofthecutsReplicationfillsinthegapsduplicatingthesequencesflankingThetransposon復制轉座子的旁側

序列，填補空隙第39頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月2?插入序列的復制性轉座第40頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月插入序列的復制性轉座第42頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月轉座子(transposons)——可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座子轉座轉座子組成：

反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因第43頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

細菌的可流動性元件A插入序列：轉座酶編碼基因兩側連接反向末端重復序列(箭頭所示)B轉座子Tn3：含有轉座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L第44頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月由轉座子介導的轉座第45頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

重組DNA技術

又稱DNA克隆或分子克隆

DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone第46頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA技術的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗。1973年

美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子。1977年

美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年

開始建造第一家應用重組DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年

英國羅林研究所成功的克隆了多莉。第47頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月相關概念DNA克隆

工具酶

目的基因

基因載體基本原理

重組DNA技術與醫(yī)學的關系主要內(nèi)容：第48頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月一、重組DNA技術相關概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。克隆化(cloning):

獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。（一）DNA克隆分子克隆

（DNA克?。┘毎寺?/p>

個體克隆

（動物或植物）

技術水平

第49頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA結合成具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)即重組體，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆各種來源的DNA即目的DNA,也叫外源DNA第50頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術工程:

基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA技術/重組DNA工藝學。第51頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶（基因工程中重要的酶）

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶

DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶(PCR技術中應用的一種耐熱的DNA聚合酶，95度不變性)第52頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA技術中常用的工具酶工

具

酶功

能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第53頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。是細菌內(nèi)是細菌內(nèi)存在的保護性酶，如果有外來的DNA進入細菌內(nèi)，則RE將其水解掉，對細菌自身起保護作用。限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease，RE)第54頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)現(xiàn)1970年，美國的HamiltonSmith偶然發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌（HaemophilusinfluenzaeRd）能降解外源噬菌體DNA，且該菌的無細胞的抽提液也具有降解（酶）活性。該酶能降解E.coliDNA，但不降解產(chǎn)生該酶的Haemophilus自身細胞DNA，稱該酶為HindⅡ，能結合并識別的DNA序列為：限制性內(nèi)切酶能夠在DNA上尋找特定的位點切斷雙鏈，被稱為“分子剪刀”。5′-G-T-Py-↓-Pu-A-C-3′3′-C-A-Pu-↑-Py-T-G-5′（Py=嘧啶、Pu=嘌呤）第55頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

特點1）均來自微生物，并據(jù)此而進行命名；2）特異識別連續(xù)的4、6或8個堿基；按其識別順序可以計算切割幾率：假定四種堿基在DNA鏈上隨機分布，則識別4、6、8個堿基順序出現(xiàn)的幾率分別是1/44、1/46、1/48（識別順序出現(xiàn)的堿基間隔）。識別序列越長、切點越少。3）識別序列多具有回文結構（palindrome）；即識別序列呈二元旋轉對稱?；匚慕Y構多數(shù)不是重要的結構基因。4）其切割后的DNA可產(chǎn)生不同的末端。第56頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月作用：GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）

與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA?；匚慕Y構第57頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株

序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第58頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月I：切割位點：非特異性，跟識別位點大于1000bpII:同于或接近于識別部位III:跟識別位點3端24-26bp處切割位點：第59頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

限制修飾系統(tǒng)

(RestrictionandModificationSystem)限制性核酸內(nèi)切酶與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA第60頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口

：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第61頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月二元旋轉對稱，即從到的方向閱讀是完全相同的5′3′

識別的回文結構為短小序列大多為4-6bp回文結構指的是：二元旋轉對稱(180度旋轉)，即點對稱注意：線對稱不是回文結構第62頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第63頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶識別序列長度為4－8個bp，6個最多見。不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱配伍末端（compatibleend),可用連接酶連接。粘性末端端突出端突出5′－3′－5′AATTC——3′G——5′G——3′AATTC——第64頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月SATORAREPOTENETOPERAROTAS具有反向重復序列的是：A、CGGTAGCTAGTTCGB、CGAGGATTAGGAGCC、AAGGTTCGAACCTTD、TTACGTATTACGTA第65頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：第66頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶第67頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月名稱

識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶第68頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）目的基因(targetgene)

應用重組DNA技術所要分離、獲得的基因。

應用重組DNA技術的目：1、為分離、獲得某種感興趣的基因或DNA序列，即目的基因（targetDNA）或外源DNA。2?為獲得目的基因的表達產(chǎn)物—蛋白質第69頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA(complementaryDNA)雙稱互補DNA

指經(jīng)反轉錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應可合成雙鏈cDNA。

基因組DNA(genomicDNA)

指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

目的基因的類型：DNA克隆時構建的嵌合體DNA組成包括：載體DNA+目的DNA第70頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月獲取目的基因的方法：1、直接從組織或細胞染色體DNA中分離，限制性酶切；2、利用DNA合成儀化學法合成，或用PCR法擴增；3、提取mRNA反轉錄合成cDNA直接克隆，或建立c-文庫再從中篩選。4、利用鳥槍法建立G-文庫，再用核酸探針從基因文庫中“釣”取。5、PCR方法第71頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）基因載體

定義能攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的可獨立復制的完整的一些DNA分子。又稱克隆載體。其中為表達出蛋白質設計的載體又稱表達載體。

常用載體質粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA第72頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。(大量獲得基因片段)表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成

多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。(大量獲得表達產(chǎn)物)第73頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的選擇標準：能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。第74頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月理想基因載體應具備的條件可在宿主細胞內(nèi)自行復制（具有自身的復制子并能攜帶外源性DNA一同擴增）；有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點（多克隆位點）；載體分子應盡可能小，可插入較大的外源DNA而不影響復制；有兩個以上的篩選標記（抗藥性、酶基因、營養(yǎng)缺陷型、形成嗜菌斑等）?？截悢?shù)多、與宿主易于分離、抗剪切力強。表達型載體應配備與宿主細胞適應的啟動子、前導順序、增強子等。第75頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒

(plasmid)特點:能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。

是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對。常有1－3個抗藥性基因，以利于篩選，能加0.1－10kb的基因第76頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月以大腸桿菌中的質粒載體為例：大腸桿菌有一套自己的染色體，在染色體之外還有一環(huán)狀DNA拿出來，因為它體積小，容易操作，通過人工改造變成載體。載體有幾個重要部分：1、用來復制的部分：克隆的話需要復制，要有調(diào)控的元件2、人工改造的部分，用來篩選轉到細胞是否成功。因為這一段的編碼產(chǎn)物可以對抗抗菌素對宿主細胞的殺傷。如氨芐青霉素抗性基因，根據(jù)需要的不同選擇不同的抗性基因。3、裝上LacZ基因：乳糖操縱子，外界給了乳糖，可變成半乳糖，如果沒有葡萄糖LacZ如果成功轉到大腸桿菌，就會產(chǎn)生在含有X-gal、IPTG的培養(yǎng)基培養(yǎng)，B-半糖苷酶分解X-gal的顯色反應很靈敏。B-半糖苷酶可以分解X-gal變成藍色，如果這個基因遭到破壞，不能合成B-半糖苷酶，不能分解X-gal而呈白色，IPTG半乳糖的類似物，很有效地啟動乳糖操縱子的基因轉錄。第77頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月人工構建質粒PBR322全長4363堿基對，有一個復制起始點，2個抗生素的抗性基因（氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因）有多個單一的酶切位點第78頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第79頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克隆－目的基因較小）EMBL系列（置換型，適用基因組克?。康幕蜉^在大）噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第80頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月對λ噬菌體DNA中間部分進行改造，替換原來的結構基因，裝上目的基因，利用它容易感染原核和真核細胞的性質，把目的基因帶進去，其容量高，80－20Kb病毒載體用的越來越多，因為病毒感染細胞的效率非常高（如，大腸桿菌載體效率不高）而病毒幾乎百分之百。病毒依靠表面的蛋白質與宿主細胞結合，去感染，把它的內(nèi)容物釋放到宿主細胞內(nèi)。病毒基因組在兩頭有包裝信號，中間是病毒的結構基因，第一步改造是把兩頭的結構信號拿掉，僅把結構基因重組，轉到宿主細胞，能轉成功的話，進入的全是結構基因與宿主的基因組整合，利用宿主的一切系統(tǒng)，把它的所有基因產(chǎn)物表達出來，在胞漿呆著，叫包裝細胞；第二步，包裝信號與目的基因重組，然后再與載體重組，轉染到剛才已經(jīng)建好的包裝細胞中。包裝信號是與目的基因連在一起的，利用宿主的基因組不斷復制更多的帶目的基因和包裝信號的片段，這些片段當它與與已經(jīng)有了的病毒蛋白相遇，包裝信號發(fā)揮作用，可以包裝成新的病毒（含有目基因但沒有病毒的結構基因了），有感染力但無結構基因了。第81頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

柯斯質粒(cosmid)酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)

細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)

動物病毒DNA改造的載體

（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）3、其他第82頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月粘性質粒(cosmid)第83頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月二、重組DNA技術基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

第84頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月如果要獲得一個DNA克隆，操作：1、從真核生物染色體DNA中獲取目的DNA。2、基因載體的選擇和構建，如質粒。3、將載體和目的基因用同一種限制性內(nèi)切酶來切割，產(chǎn)生相同的粘性末端。4、切割后將載體與目的基因連接起來（外源基因與載體的并接成重組體）。5、將重組體導入受體細菌（細胞）。6、篩選出含有重組體的轉化子細胞，并無性繁殖重組體的目的基因（細菌擴增得到DNA克隆）。7、如果要獲得蛋白質，最終還需要表達。第85頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月Host宿主細胞E.Coli–the“factory”usedinthegeneticengineeringofinsulin第86頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月有了基因有了載體，要想最終實現(xiàn)獲得大量基因或產(chǎn)物，最終都要放到hostcells實現(xiàn)。最常用的有3類：大腸桿菌、單細胞的真核生物（酵母B4）真核哺育類細胞。拿基因根據(jù)目的不同，取的組織或細胞不同第87頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

以

質

粒

為

載

體

的DNA

克

隆

過

程第88頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）目的基因的獲?。只瘜W合成法（化學合成儀）

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列

；或可推導出序列的基因，如胰島素的基因、干擾素的基因。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)第89頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1?化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。第90頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。簡稱G－文庫。它表達了細胞整套基因。2、從基因組DNA文庫獲取目的基因第91頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月基因文庫：提純生物體全部DNA，用限制性內(nèi)切酶隨機切割成大致相同的數(shù)以萬計的片段，重組入同一類載體上，轉化宿主菌保存，即得基因文庫。（1）G-文庫：用基因組總DNA制備的基因庫。（2）c-文庫：用細胞全部mRNA經(jīng)反轉錄制備全套cDNA后建立的基因庫。G-文庫比c-文庫基因數(shù)目多第92頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月就研究一個基因，而且知道這個基因組織中是表達的，表達量多，先抽提其RNA，是否抽提成功，跑電泳，成功的RNA是5.8S18S28S三個條帶非常清楚，如果5.8S不清楚，湊合用，如果28S18S不清楚，不能用，自然界包括手上都有RNA酶，所以做RNA實驗時要在一個獨立的空間，所有東西都獨立，不能與別的實驗混合。得到的是總RNA，我們需要的是mRNA，mRNA尾巴上有polyA，利用這個特別純化，去掉tRNA、rRNA，有了mRNA為模板，加入dNTP，合成的是DNA，叫cDNA，cDNA相當穩(wěn)定，可以長期保存下來。有了cDNA，酶、引物、底物通過PCR技術，大量擴增。由于知道想做的這段基因的分子量，如果想知道這段基因的分子量，跑電泳，就可以大概知道拿到的這段基因是不是想要的基因，如果與理論基因分子量是對應的，那就可能是，最終的結論還需要測序。如果是想要的基因，與載體重組，重組后轉到細胞內(nèi)，轉到細胞有三種方法：化學的、物理的，生物的。物理的方法比較簡單有基因槍，電轉；化學的方法，比如用Ca2+Cl2處理細胞，細胞表面的膜變得疏松，載體容易進入。質子體感染、病毒感染等都可以轉入細胞是否轉進去，就開始篩。用抗生素先篩質粒是否轉進去了，再用藍白斑篩目的基因是否進去（藍斑沒有進去，白斑進去了）第93頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月限制酶切位點限制酶消化

除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化

外源DNA與載體DNA混合

連接反應

體外包裝

用重組噬菌體感染大腸桿菌

~20KbDNA片段

cosLRcos~20Kb外源DNA片段

基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構建基因文庫

第94頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子

cDNA文庫

反轉錄酶

載體

受體菌

復制3、

從cDNA文庫獲取目的基因

提取細胞全部的mRNA做模板，通過逆轉錄合成互補的全套雙鏈cDNA后,建立的基因文庫。

簡稱c－文庫。第95頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

cDNA文庫逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT第96頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

是一種在體外利用酶促反應大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術，又稱為無細胞的分子克隆。(polymerasechainreaction)

PCR是根據(jù)DNA復制的原理，在體外利用酶促反應獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術。4、聚合酶鏈反應（PCR）第97頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第98頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月第99頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

PCR是根據(jù)復制的原理，在體外利用酶促反應獲得特異序列的基因組DNA或者cDNA的專門技術。

PCR的反應體系：模板DNA、特異性引物、DNA聚合酶、dNT及含有Mg2+的沖液（激活劑）。第100頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1、變性：將反應系統(tǒng)加熱至95℃，使模板DNA完全變性解開成單鏈；2、退火（復性）：將溫度降至適宜（50℃左右），使引物與模板DNA互補結合；3、延伸：將溫度升至72℃，DNA聚合酶以4種dNTP為底

物，在引物的3’-OH上，合成與模板互補的DNA新鏈。上述三個步驟為一個循環(huán)，經(jīng)過25－30次循環(huán)后，指數(shù)增長可將模板DNA擴增達百萬倍。PCR的基本反應步驟及原理

第101頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

PCR反應條件

變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第102頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）克隆載體的選擇和構建－選根據(jù)目的基因的性質、含有哪種核酸內(nèi)切酶的酶切位點、目的基因片段的大小等選擇適當?shù)目寺≥d體，目前克隆載體已商品化，購買即可。目的不同，操作基因的性質不同，載體的選擇和改建方法也不同。第103頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月載體插入DNA片段宿主細胞質粒<5~10kb細菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細菌黏粒~50kb細菌BAC~400kb細菌YAC~3Mb酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞第104頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）外源基因與載體的連接－

接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接（連接成重組體）第105頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月粘性末端連接

GGATCCCCTAGG

GGATCCCCTAGG

G

GATCCCCTAG

G

G

GATCCCCTAG

G

GGATCCCCTAGGDNA連接酶

目的基因DNA和載體DNA都含有同一個限制性內(nèi)切酶的酶切點，用同一種酶來切割，產(chǎn)生相同的粘性末端（配伍末端）。第106頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用

BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接第107頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。第108頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月平端連接

適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端不是配伍的粘端經(jīng)特殊酶的處理（補齊或切平）變?yōu)槠蕉恕Ｈ缒┒撕怂徂D移酶將其補齊或用核酸內(nèi)切酶將突出的一端其水解掉，切平變?yōu)槠蕉恕５?09頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因

自連第110頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月同聚物加尾連接由末端轉移酶(terminaltransferase)的作用，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。如將兩條鏈的一條鏈接上TTTT,另一條鏈的末端都接上AAAA，TTTT和AAAA就成了互補的末端，就可以連接。第111頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′第112頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

人工接頭(linker)連接人工接頭是一段含有限制性內(nèi)切酶的酶切位點的寡核苷酸。將平端加上帶有新的酶切位點的寡核苷酸鏈（即加上人工接頭），再用限制性內(nèi)切酶來切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。也就是將載體和目的基因都加上人工接頭，或者是目的基因已經(jīng)有了一個限制性內(nèi)切酶的粘性末端，可以在載體上加一人工接頭，產(chǎn)生相同的粘性末端。第113頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第114頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月受體菌條件：安全宿主菌（人工處理不致病的大腸桿菌）

限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

容易接受重組DNA）

導入方式：轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌－轉第115頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）重組體的篩選與鑒定－篩重組DNA導入受體菌后，經(jīng)過培養(yǎng)使其大量繁殖，再設法將含有目的基因的菌落區(qū)分鑒定出來，這一過程即為篩選（screening)或選擇（selecting)。第116頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1.借助載體上的遺傳標志進行篩選

(1)利用抗生素抗性標志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達特性篩選(3)利用標志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選

篩第117頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法

(3)核酸雜交法(4)DNA測序法

3.親和篩選法第118頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月1.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等重組體的篩選方法有：第119頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月針對載體攜帶某種或某些標志基因和目的基因而設計的篩選方法。其特點是直接測定基因或基因表型。

(1)抗藥性標記選擇

(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交

Southern印跡1、直接選擇法第120頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）、抗藥性標記法（插入失活法）將目的基因插入帶芐青霉素抗性基因（amp）和四環(huán)素抗性基因（tet）的載體中的tet基因中（兩個抗性基因之一中），則被插入的tet基因失活。在分別含有氨芐青霉素和含有四環(huán)素的兩個培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再進行篩選。如果基因不失活，比如氨芐青霉素基因不失活，那么在氨芐青霉素存在的情況下培養(yǎng)能生長，可以抵抗抗生素（氨芐青霉素）；如果這個基因失活了，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中就不能抵抗四環(huán)素，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中就不能生長。根據(jù)生長情況來篩選。第121頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月(插入失活法)

抗藥性標記選擇第122頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月如質粒pBR322,含有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗性基因，將目的基因插入到四環(huán)素抗性基因的位置，如果重組成功了，插入后轉入受體菌進行培養(yǎng)，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長（氨芐青霉素基因正常）；在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不生長，可判斷重組體重組成功，如果沒重組成功，它在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中都生長，以此來判斷哪個是重組體，哪個不是重組體。第123頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）、標志補救（markerrescue）若目的基因能夠在宿主菌表達，且表達產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補，就可利用對營養(yǎng)素的依賴表型來篩選。如α互補的原理：第124頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月α互補利用α互補原理篩選重組體pUC18X-gal

:半乳糖苷酶的底物IPTG:乳糖操縱子的強誘導劑第125頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體構建的質粒PUC1819，含有l(wèi)acZ基因，編碼的蛋白質是B-半乳糖苷酶，但它是N端的部分序列。要轉入的大腸桿菌的染色體中含有B-半乳糖苷酶的C端編碼序列，只有這個質粒轉到細菌后，質鑿的基因和大腸桿菌的基因同時表達，然后兩個結合在一起，細菌才有B-半乳糖苷酶活性，有了B-半乳糖苷酶活性才可以水解乳糖，水解乳糖后產(chǎn)生藍色的菌落。這個細菌就是營養(yǎng)缺陷性的，它缺陷B-半乳糖苷酶的N端序列，質粒補充了它的B-半乳糖苷酶基因的活性。

LacZ基因附近有一個多克隆位點，在這個位點可以插入外源DNA,如果插入了外源DNA就破壞了N端編碼序列，破壞之后再轉化到細菌內(nèi)它就不能夠編碼B-半乳糖苷酶的N端，就不能補充營養(yǎng)缺陷，這個細菌就沒有B-半乳糖苷酶的活性，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)就是白色的菌落。藍色菌落表示外源DNA沒有插入進來，如果插進來就是白色菌落。我們需要的是白色菌落，是含有重組體的細菌。將它拿出來后再擴增。（P359頁圖14－13）上圖解釋：第126頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

加入的X－gal是B-半乳糖苷酶的底物，IPTG是實驗室常用的乳糖操縱子的強誘導劑（比半乳糖的作用要強），誘導后乳糖操縱子才能表達。第127頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救目錄第128頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）、分子雜交法：利用P標記的探針與轉移至硝酸纖維素膜上的轉化子DNA或克隆的DNA片段進行分子雜交，直接選擇并鑒定目的基因。有兩種方法：原位雜交Southern印跡一般篩選需要幾種方法聯(lián)合使用。32第129頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

原位雜交第130頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

Southern印跡第131頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月2.非直接選擇法：

免疫學方法：利用特異抗體與目的基因表達產(chǎn)物相互作用進行篩選。包括：免疫化學方法酶免檢測分析因為此方法不直接鑒定基因，是鑒定的基因表達產(chǎn)物所以稱非直接選擇法。第132頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法

第133頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月表達體系的建立：表達載體的構建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達（產(chǎn)生蛋白質）表達體系分：原核表達體系：

(E.coli表達體系最為常用)

真核表達體系：

（如：酵母、昆蟲、乳類動物細胞）第134頁，課件共159頁，創(chuàng)作于2023年2月

標準：選擇標志 強啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點

E.coli表達體系的不足：缺乏轉錄后和翻譯后的加工機制不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質；表達的蛋白質常形成不溶性包涵體

(inclusionbody)

；很難表達大量可溶性蛋白。1.原核表達體系(E.coli表達體系最為常用)第135頁，課件共159