利用腸黏膜基因組差異表達(dá)研制抗應(yīng)激添加劑

利用腸黏膜基因組差異表達(dá)研制抗應(yīng)激添加劑第1頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月匯報提綱研究背景、目的

研究技術(shù)路線與方法結(jié)果與分析

結(jié)論

有待進一步研究的問題第2頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月一、研究背景及目的應(yīng)激夏季高溫對養(yǎng)豬生產(chǎn)的影響高溫與胃腸道損傷修復(fù)基因芯片在豬熱應(yīng)激中的應(yīng)用第3頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)激的種類飼管因素運輸因素

環(huán)境因素

防治因素

中毒因素

心理因素

其他因素

隨著全球性氣候變暖，高溫成為對家畜作用最廣泛和不可避免的應(yīng)激因素。人工氣候室高溫模型符合試驗因子單一化研究應(yīng)激機制。第4頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熱應(yīng)激環(huán)境溫度超過豬的等熱區(qū)上限，豬體溫超過39.5℃，產(chǎn)熱大于散熱。免疫機能生產(chǎn)性能經(jīng)濟損失生理指標(biāo)行為改變胃腸道損傷第5頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)激與應(yīng)激性潰瘍應(yīng)激性潰瘍：應(yīng)激中機體為了保護心、腦等重要器官，全身血液重新分配，胃腸道血流量明顯減少。導(dǎo)致小腸黏膜急性損傷，因此，腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官。第6頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月高溫與腸黏膜屏障的損傷修復(fù)小腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)的完整性免疫功能——第一道防御屏障生產(chǎn)性能——營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用第7頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月基因芯片在豬熱應(yīng)激中的運用基因芯片（基因微陣列）cDNAmicroarrayAffymetrixGeneChip?PorcineGenomeArray，包含23,937個探針組，代表20,201個基因。應(yīng)用豬全基因組已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，對23937個探針以及雜交信號進行靈敏、準(zhǔn)確的檢測分析，實時同步高通量評價豬的熱應(yīng)激反應(yīng)。第8頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月實時同步高通量評價豬的熱應(yīng)激基因芯片熱應(yīng)激從豬熱應(yīng)激及中藥兩個角度對多參數(shù)實時同步分析，探討熱應(yīng)激機制并發(fā)掘藥物靶點，為多層次評價中藥作用提供工具。改善環(huán)境營養(yǎng)調(diào)控抗熱應(yīng)激藥物（中藥添加劑）中藥第9頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月研究目的、意義通過豬在人工氣候室連續(xù)10天26-40℃的循環(huán)變溫刺激，從小腸黏膜形態(tài)學(xué)、與損傷修復(fù)相關(guān)的EGF/EGFR等生長因子與mRNA水平以及信號通道等方面探討高溫對豬小腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷的影響及中藥調(diào)控機制，為開發(fā)抗熱應(yīng)激中藥添加劑以及小腸損傷修復(fù)劑奠定基礎(chǔ)。第10頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月二、技術(shù)路線和方法實驗動物：48頭2月齡、體重7.15±0.61kg的中國實驗用小型豬（CEMP,農(nóng)大I系）。

人工氣候室：中國農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)國家重點開放實驗室。石香顆粒：功效為防治高溫引起的機體免疫力下降及生產(chǎn)性能下降。其中鹽酸小檗堿含量1.0mg/g。用法：飲水；用量：0.15g/kg·bw。連用10天。

主要藥味包括蒼術(shù)(RhizomaAtractylodis)、藿香(HerbaAgastachis)、黃柏(CortexPhellodendri)、石膏(GypsumFibrosum)等。第11頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月退熱及中樞鎮(zhèn)痛作用增強巨噬細(xì)胞吞噬功能增強細(xì)胞和體液免疫功能抗菌、鎮(zhèn)痛、解熱作用促進胃液分泌，解除胃腸痙攣燥濕健脾。用于脘腹脹滿，泄瀉，水腫.調(diào)節(jié)胃腸運動，調(diào)節(jié)黏膜免疫抗病原微生物、抗?jié)冏饔?、抗菌、清熱燥濕免疫調(diào)節(jié)作用蒼術(shù)藿香黃柏石膏石香顆粒第12頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)路線21000，41000個基因豬熱應(yīng)激模型大鼠熱應(yīng)激模型模型評價小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察基因芯片分析關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子相關(guān)性分析IEC-6細(xì)胞熱應(yīng)激模型細(xì)胞形態(tài)、活力、凋亡生長因子表達(dá)變化ERK1/2信號通路的變化相關(guān)性分析10個生長因子和ERK1/2信號通路第13頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)路線小腸形態(tài)學(xué)觀察高溫組體內(nèi)體外生產(chǎn)性能生理指標(biāo)腸上皮細(xì)胞組織學(xué)觀察IEC-6形態(tài)學(xué)觀察ERK1/ERK2細(xì)胞活力/細(xì)胞周期中藥組對照組損傷指標(biāo)觀察臨床觀察基因芯片評價生長因子mRNA信號通道Pathway分類EST分析功能分析（GO分類）高通量快速篩選平臺第14頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月三結(jié)果與分析NameAvg.TemperatureMin.TemperatureMaxTemperatureStandardDeviationEmissivityControl35.4°C27.4°C38.3°C0.740.95HeatStress37.4°C28.9°C39.5°C0.580.95（一）高溫模型及對豬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷及中藥的修復(fù)作用第15頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熱應(yīng)激前后豬肛溫變化熱應(yīng)激前后血清皮質(zhì)醇變化第16頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月直腸溫度及平均日增重Table.Rectaltemperatureandaveragedailygain注：同行小寫字母相同者代表組間差異不顯著；不同者代表組間差異顯著(P<0.05)第17頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熱應(yīng)激豬小腸黏膜的形態(tài)學(xué)變化左列為對照組中列為高溫組右列為中藥組上行為十二指腸中行為空腸下行為回腸第18頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月高溫對豬空腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響A為對照組，B為高溫組；10000×電鏡顯示，小腸微絨毛變短；細(xì)胞核沒有明顯變化；線粒體、轉(zhuǎn)運小泡及次級溶酶體數(shù)量增加。50000×電鏡顯示空腸上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量增加，線粒體內(nèi)部脊突變短，腫脹，內(nèi)部已有空泡形成；次級溶酶體數(shù)量增加，從形態(tài)上顯示，膜包被的電子密度不同的多胞體結(jié)構(gòu)清晰可見；在沒有脫落的空腸上皮細(xì)胞間緊密連接以及細(xì)胞核沒有明顯變化。

50000×10000×第19頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熱應(yīng)激豬空腸組織基因表達(dá)譜變化對照組高溫組RNA提取反轉(zhuǎn)錄cDNAcRNA合成芯片雜交生物學(xué)分析芯片驗證EST分析GOMAPPING分析PATHWAY分析中藥組驗證（二）高溫對豬空腸黏膜基因差異表達(dá)的影響第20頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因比較結(jié)果AffymetrixGeneChip?PorcineGenomeArray含有23,937條探針代表已知豬的20,201個基因。高溫組與對照組比較（差異倍數(shù)＞±2.0）基因基因數(shù)量比例%表達(dá)基因1632171.6%不表達(dá)基因630327.6%表達(dá)上調(diào)930.41%表達(dá)下調(diào)1100.49%臨界基因1860.8%第21頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因的聚類分析第22頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因列表探針號變化倍數(shù)基因庫編號基因名稱第23頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR驗證變化趨勢一致，芯片數(shù)據(jù)可靠第24頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因GO分類圖細(xì)胞過程磷酸化過程細(xì)胞成分細(xì)胞蛋白結(jié)合發(fā)育刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)生物進程信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活蛋白復(fù)合物繁殖其它反應(yīng)激活細(xì)胞器細(xì)胞器成分胞外區(qū)GO名總數(shù)百分率GO分類：細(xì)胞成分，生物進程，分子功能三大類。第25頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因分子功能分析第26頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因生物進程分析第27頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞組分分析第28頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因的Pathway分析第29頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月主要的生長因子Epidermalgrowthfactor(EGF)表皮生長因子

Bonemorphogeneticproteins(BMPs)骨形成蛋白Erythropoietin(EPO)紅細(xì)胞生成素Fibroblastgrowthfactor(FGF)成纖維細(xì)胞生長因子Granulocyte-colonystimulatingfactor(G-CSF)粒系集落刺激因子Growthdifferentiationfactor-9(GDF9)生長分化因子-9Hepatocytegrowthfactor(HGF)肝細(xì)胞生長因子Insulin-likegrowthfactor(IGF)胰島素樣生長因子Growthdifferentiationfactor-15(GDF-15)生長分化因子-15Nervegrowthfactor(NGF)神經(jīng)生長因子Platelet-derivedgrowthfactor(PDGF)血小板衍生生長因子Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)血管內(nèi)皮生長因子第30頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月差異基因net圖第31頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）體外IEC-6熱應(yīng)激模型及高通量快速篩選抗應(yīng)激添加劑模型的建立及評價熱應(yīng)激和ERK1/2信號通路對大鼠IEC-6細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響熱應(yīng)激對大鼠空腸和IEC-6細(xì)胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平的影響利用體外IEC-6熱應(yīng)激評價平臺和差異顯示生長基因高通量篩選抗應(yīng)激中藥活性部分——蒼術(shù)、藿香揮發(fā)油

第32頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熱應(yīng)激對IEC-6細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖活力和凋亡的影響第33頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月熱應(yīng)激和ERK1/2信號對大鼠IEC-6細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響第34頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月大鼠空腸和IEC-6細(xì)胞ERK1/2的磷酸化水平第35頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月高溫對IEC-6細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖指數(shù)及

中藥有效部分的影響組別GroupsG0/1期細(xì)胞G0/1cell(%)G期細(xì)胞Gcell(%)S期細(xì)胞Scell(%)增殖指數(shù)PI(%)細(xì)胞活力(OD570)對照組CG74.2±3.1b6.9±2.6a18.8±3.9a25.8±3.1a0.757±0.010a高溫組HTG84.4±3.5a4.7±1.8b10.9±1.7c15.6±3.5c0.737±0.005b蒼術(shù)油組RHAAG77.7±1.4b6.0±1.2a16.2±2.5ab22.2±1.4a0.750±0.008a藿香油組HAAG80.1±0.8a6.4±2.2a13.5±1.5c19.9±0.8b0.754±0.005a注：同列小寫字母相同者代表組間差異不顯著；不同者代表組間差異顯著(P<0.05)第36頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月IEC-6在高溫中EGF/EGFRmRNA的變化及中藥調(diào)控第37頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月中藥對IEC-6在高溫中P-ERK1/ERK2的影響第38頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月小結(jié)1、熱應(yīng)激導(dǎo)致大鼠IEC-6細(xì)胞形態(tài)損傷，降低細(xì)胞增殖活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2、熱應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠空腸和IEC-6細(xì)胞的ERK1/2信號蛋白磷酸化，并改變IEC-6細(xì)胞生長因子的表達(dá)水平。3、抑制ERK1/2蛋白磷酸化后，熱應(yīng)激引起更為嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)更為嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡。4、熱應(yīng)激時ERK1/2信號參與生長因子表達(dá)的調(diào)節(jié)。5、體外細(xì)胞應(yīng)激模型可以作為高通量篩選中藥有效部分的平臺第39頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月四.結(jié)論熱應(yīng)激豬26～40℃循環(huán)高溫模型成立。石香顆粒通過調(diào)節(jié)豬體溫，減少小腸上皮細(xì)胞、腸絨毛損傷，石香顆粒通過維護小腸黏膜屏障的完整性和營養(yǎng)吸收功能，發(fā)揮抗熱應(yīng)激作用。熱應(yīng)激導(dǎo)致豬空腸基因表達(dá)差異。芯片HSPs、EGF、EGFR等生長因子mRNA驗證結(jié)果表明可靠。這些差異基因涉及機體內(nèi)分泌、免疫功能、細(xì)胞損傷和修復(fù)、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。第40頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月Pathway分析預(yù)測花生四烯酸代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、亞麻仁油酸代謝途徑、細(xì)胞色素P450代謝途徑和MAPK信號通路在熱應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用。豬小腸黏膜損傷修復(fù)的基因信號通道與EGF介導(dǎo)的細(xì)胞的損傷，修復(fù)相關(guān)。石香顆粒主要成分通過顯著促進對EGFR的表達(dá)，啟動基因轉(zhuǎn)錄，促進細(xì)胞增殖，損傷的修復(fù)。第41頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月五.有待進一步研究的問題高溫對豬空腸的基因差異表達(dá)基因為203個；其中上調(diào)有的93個；下調(diào)的有110個。繼續(xù)進行高溫對豬熱應(yīng)激影響機制的研究，開發(fā)抗熱應(yīng)激和小腸黏膜損傷修復(fù)劑。第42頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月與動物熱應(yīng)激中腸黏膜屏障相關(guān)的SCI論文LiuFH,YinJD,DuM,YanPS,XuJQ,ZhuXY,YuJ.HeatStressinducedDamagetoPorcineSmallIntestinalEpitheliumassociatedwithDown-RegulationofEpithelialGrowthFactor(EGF)Signaling.JournalofAnimalScience.2009,6(87):1941-1949,IF2.466.YuJin,YinPeng,LiuFenghua..InvolvementofERK1/2signalingpathwayinheatstress-induceddamageandexpressionchangeofgrowthfactorsinratjejunumandIEC-6cells.International

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Hyperthermia.2010，10;26(6):538–555.IF2.713.SongXZ,XuJQ,WangT,LiuFH.Chinesemedicinegranuleaffectstheabsorptionandtransportofglucoseinporcinesmallintestinalbrushbordermembranevesiclesunderheatstress.Asian-Australasianjournalofanimalsciences.2009,20：246-254.IF0.875SongXZ,XuJQ,WangT,LiuFH.TraditionalChinesemedicinedecoctionenhancesgrowthperformanceandintestinalglucoseabsorptioninheatstressedpigsbyup-regulatingtheexpressionsofSGLT1andGLUT2mRNA.2009.LivestockScience.128(2010)75–81)IF1.41JinYu,PengYin,FenghuaLiu,XiaoyuZhu,GuilinCh