課題申書實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示例第2組

專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)（五年制）班級：05級十四班 鼻咽癌是頭頸部常見的之一。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)將編碼細(xì)胞因子的導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞構(gòu)建腫瘤疫苗經(jīng)γ射線等處理后使其失去性而保存分泌細(xì)胞因子的能力，通過細(xì)胞因子生物學(xué)活性，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性及抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。人白細(xì)胞介素24(IL-24)，又名黑色素瘤分化相關(guān)抗原7(MDA-7)，是1995年JiangH等人利用減數(shù)雜交技術(shù)從β-干擾素(IFN-β)和蛋白激酶激活MEZ誘導(dǎo)分化的人惡性黑色素瘤細(xì)胞HO-1中克隆的新。人IL-24(hIL-24)具有廣譜抗腫瘤活性，接導(dǎo)入瘤細(xì)胞內(nèi)，使瘤細(xì)胞自泌細(xì)胞因子，以發(fā)揮殺瘤效應(yīng)。本課題設(shè)計(jì)中應(yīng)用Lipofectamine2000將攜帶人IL-24的pcDNA3.1(hIL-24HNE1隆并運(yùn)用RT–PCR檢測轉(zhuǎn)入的人IL-24在細(xì)胞中表達(dá)水平同WesternblothIL-24，而對照和空載體組不表達(dá)hIL-24。最后用ELISA法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞在24h內(nèi)分泌IL–24的含量。鼻咽癌免疫治療已取得了許多進(jìn)展如腫瘤CTL過繼性免疫治療、細(xì)胞因子治療等，主要的治療方法有p53療法、bax療法及EB相關(guān)的BHRF1反義寡核苷酸LMP1染IL-24的細(xì)胞能分泌hIL-24。并能成功地整合到細(xì)胞組鼻咽癌()是我國尤其是地區(qū)高發(fā)的之一，多屬，鼻咽部深居頭顱，毗鄰重要、血管和神經(jīng)組織，單純手術(shù)難以根治，然而本病對放射線具有較高敏感性病灶及頸淋巴放射治療的5年存活率僅為50％左右。近年來盡管同期放化療對提，早期便了解的EB與鼻咽癌的發(fā)生有密切關(guān)系的基礎(chǔ)上，近期研究相繼揭示了發(fā)生的其他相關(guān)因素如多重腫瘤抑制p16的缺失和突變、抑癌p130在mRNA水平上表達(dá)量的減少等。而在hIL-18能夠經(jīng)過轉(zhuǎn)染而在鼻咽癌細(xì)胞株SUNE中強(qiáng)烈表達(dá)，并可通過誘導(dǎo)Perforin的表達(dá)而增強(qiáng)外周血CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，從而強(qiáng)烈腫瘤細(xì)胞。運(yùn)用抑癌細(xì)胞T細(xì)胞或單核細(xì)胞，并能夠?qū)ζ渌准?xì)胞群起作用（例如單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，使酸性粒細(xì)胞等。利用相關(guān)免疫學(xué)原理將表明，反義hIL-10和反義性hIL-10可顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞在hu-PBL-SCID鼠體內(nèi)的成瘤作用，而hIL-2免疫治療對和提高鼻三、hIL-2424(Interleukin．24，IL-24)，又名黑色素瘤分化相關(guān)7(melanomadifferentiation-associatedantigen，MDA-7)1995年JiangH等人利用減數(shù)雜交技術(shù)誘導(dǎo)分化的人惡性黑色素瘤細(xì)胞HO-1中克隆的新。人IL-24具有廣譜抗腫瘤活性，對多種組織來源的胞沒有影響。IL-24還具有誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-12等具有抗腫瘤活性的二級細(xì)胞因子的功能，IL-24細(xì)胞凋亡，同時又刺激表達(dá)細(xì)胞因子的。目前，國內(nèi)外對hIL-24這一新已有了較為深入的研究，其與腫瘤治療的關(guān)系而言，IL-24的抑癌機(jī)制復(fù)雜，可通過調(diào)節(jié)p38MAPK、PKR、p-聯(lián)蛋白、PI3K、ERK1/2和JNKI/2信號通路；干擾線粒體功能和增加ROSDNA人白細(xì)胞介素-24的表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，這就為進(jìn)一步研究hIL-24的功能及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為其在最終在真核細(xì)胞內(nèi)1hIL24DNApcDNA31(hIL24)①pcDNA3.1質(zhì)粒，②Hind、BamHⅠ，③T4DNA④pfuDNA聚合（高保真PCRM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPOlig(dT)⑤根據(jù)GenBank中報(bào)告的hIL24cDNA序列設(shè)計(jì)，上游引物5’-ATGAATTTTCAACAGAGGC3’，下游引物:5CTAGTAGAATTTCT-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物約621bp；由生物工程有限公3、hIL24①BIOZOL總RNA提取試劑盒（杭州博日科技②DNA③兔抗人IL24④辣根過氧化物酶(HRP)⑤ECL⑥hIL24ELISA一、hIL24DNApcDNA3.1hIL24)的構(gòu)建中析出，加0.1×TE溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?、PCR大量擴(kuò)增hIL24DNAAATTTTCAACAGAGGC-3’、下游引物5’-CTAGAGCTTGTAGAATTTCT-3’、fpuDNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液、石蠟油等–3、用酶切法對所得的hIL24cDNA用限制性核酸內(nèi)切酶對DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品和hIL–24cDNA序保證PCR擴(kuò)增出的hIL–24cDNA序列是本實(shí)驗(yàn)所需的。4、構(gòu)建hIL24的質(zhì)粒BamHⅠpcDNA3.1和hIL-24cDNA連接，構(gòu)建出hIL-24的質(zhì)粒DNA(pcDNA3.1(+)-hIL-24)。二、hIL24DNA采取脂法，以脂包裹重組質(zhì)粒DNA，再與Hela細(xì)胞融合將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，同時設(shè)空載體及不轉(zhuǎn)染細(xì)胞做對照；因?yàn)閜cDNA3.1序列中有neo，所以在轉(zhuǎn)染過程中不需要再加入neo（G418篩選法的實(shí)施要求重組質(zhì)粒序列中必須有neo），轉(zhuǎn)然后經(jīng)48h，近融合時按1：4密度傳代。繼續(xù)培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞，培養(yǎng)液進(jìn)行篩選（G418濃度可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定），同時用未加2437℃5％CO2培育箱中培養(yǎng)2~5天；當(dāng)對照細(xì)胞大部分時（2~5天后），70%融合時，將所得細(xì)胞（抗性克隆）轉(zhuǎn)入多個培養(yǎng)瓶中擴(kuò)三、hIL241、RTPCR法檢測各組細(xì)胞hIL24mRNAEDTA消化貼壁細(xì)胞，離心收集沉淀細(xì)胞，提取抗性細(xì)胞克隆、pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞的總RN（具體請見BIOZOL總RNA提取試劑盒使用說明RTPCR檢測hIL-24mRNA的轉(zhuǎn)錄2、Western-blot法檢測hIL24pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)法（SDS；電轉(zhuǎn)移；酶免疫定位）檢測hIL24的表達(dá)情況。四、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中hIL24取相同數(shù)量(106個)（pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞），分別用含1%牛白蛋白(BSA)的RPMI1640培養(yǎng)基5mL進(jìn)行培養(yǎng)。24h后，分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA法測定其中的hIL24含量，具體操作按hIL-24ELISA試劑盒說明書操作。1DNA瓊脂糖凝膠上的區(qū)帶——判斷hIL24cDNA序列和DNA分2、G4183DNA621bp位置上是否有特異性條帶——判斷hIL24cDNA1hIL–24cDNA序列進(jìn)行鑒定時，DNA瓊脂糖hIL–24cDNADNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的區(qū)帶應(yīng)該一致，說明PCR擴(kuò)增出本實(shí)驗(yàn)所需要的hIL–24cDNA；248h后，將細(xì)胞傳入培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁、生長狀況良好。加入篩選藥物G-418后，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞將全部，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞仍3、hIL-24在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)檢測結(jié)①RTPCRpcD2NA3.1hIL24的鼻咽癌細(xì)胞克隆在621bp位置可觀察到一條特異性條帶；轉(zhuǎn)入pcD2NA3.1(+)空載體的鼻咽癌細(xì)胞克隆和未轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞克隆將不會出現(xiàn)此預(yù)期條帶表明IL-24已成功地轉(zhuǎn)入鼻咽癌細(xì)胞中，并且在mRNA水平已有表達(dá)；②用兔抗人IL24多克隆抗體和HRP-羊抗兔IgG做Westernblot，在pcDNA3.1(+)-hIL-24轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞中將檢測到hIL-24的pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞中不能檢測到hIL-24的表達(dá)。4、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中hIL24按照說明書建立IL24ELISA結(jié)果顯示，l06個轉(zhuǎn)染細(xì)胞在24h內(nèi)應(yīng)能分泌大量的IL-24；空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞中未檢測到IL-24。表明轉(zhuǎn)染IL-24的鼻咽癌細(xì)胞能分泌hIL–24，而缺乏該轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞不能分泌hIL–24。瘤細(xì)胞自泌細(xì)胞因子以發(fā)揮殺瘤效應(yīng)目前已開展將IL-2INFγ、TNFα、GMCSF等細(xì)胞因子導(dǎo)入黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎癌、肺癌等多種癌細(xì)胞的研究[5～8。動物實(shí)驗(yàn)表明:導(dǎo)入細(xì)胞因子的腫瘤能顯著降低腫瘤細(xì)胞性并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性國外的研究資料表明，hIL24能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，抑制血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還具有刺激外周血單個核細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-1β及GM-CSF等具有抗腫瘤活性的二級細(xì)胞因子的功能[9]。此外，腺介導(dǎo)的hIL-24與化療或放療聯(lián)合使用能顯著提高腫瘤的效果[10，11]。所以IL-24本研究中應(yīng)用Lipofectamine2000將攜帶人IL-24的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hIL24轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞系-HNE1中，并預(yù)期以下結(jié)果——RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入的人IL-24在鼻咽癌細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)；Westernblot證實(shí)，轉(zhuǎn)染組瘤細(xì)胞表達(dá)hIL-24，而對照和空載體組不表達(dá)hIL24；ELISA106個轉(zhuǎn)染細(xì)胞在24h內(nèi)能分泌大量IL-24，空載體轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞上清液中不能檢測到IL–24，提示轉(zhuǎn)染IL-24的鼻咽癌細(xì)胞能分泌hIL24hIL24基pcDNA3.1IL-24DNA進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)1、等《分子醫(yī)學(xué)技能，科學(xué)2006年2、，，鄭家法，等.IL-24cDNA轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞系的建立及其表達(dá)的研究[J].大學(xué)學(xué)報(bào)。2007.35(3):389-391 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