基因工程的常規(guī)技術

基因工程的常規(guī)技術第1頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳（electrophoresis)帶電物質在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；第2頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月一、瓊脂糖凝膠電泳

用瓊脂糖凝膠作為支持介質的區(qū)帶電泳法。

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，是從紅色海藻中提取而來。在高溫水溶液下會溶解，常溫下凝固并形成一定大小孔徑的惰性介質，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。第3頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月1、原理DNA分子的磷酸基團在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下DNA分子向正極泳動瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用瓊脂糖的分子篩效應，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。第4頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。注意事項：EB是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。第5頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2、瓊脂糖凝膠電泳的影響因素1）樣品DNA分子大小和分子構型2）瓊脂糖濃度p33

取決于所分離DNA片段的大小3）緩沖液TAE、TBE4）電泳條件

電壓：3-5V/cm時間：30-60min第8頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的電泳緩沖液第9頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質，其分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳，用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。分離小片段DNA(1—1000bp)效果較好,其分辯力極高。聚丙烯酰胺由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。

第13頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、脈沖電場凝膠電泳（PFGE）（Pulse-fieldgelelectrophoresis

）

PFGE是交替變換電場方向的電泳，以一定的角度一定的時間變換電場方向。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小。分子越大，改變構象的時間就越長，重新定向的時間就越長，移動也就慢，反之越快?？蓞^(qū)分長度為50-100Kb以上，甚至Mb級別的大片段DNA分子。第14頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)分子雜交技術雜交的基本原理探針及探針標記雜交的基本方法第16頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基本原理變性與復性第17頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交技術：是利用DNA分子的變性、復性以及堿基互補配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進行探查的技術。第18頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月二、探針與探針標記

探針（probe）：用作檢測的被標記的短片段特異DNA或RNA序列。

第19頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）探針的種類基因組DNA探針、cDNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針（二）標記物同位素標記：32P、35S、3H等非同位素標記：地高辛、生物素、熒光素等第20頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

切口平移法

隨機引物法

KlenowDNA聚合酶3’末端補平反應

T4多核苷酸激酶5‘末端引入標記磷酸基團末端轉移酶3‘末端連接標記的核苷酸（三）探針標記方法1、均勻標記2、末端標記法第21頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月DnaseⅠ使DNA雙鏈產(chǎn)生缺口

DNA聚合酶將生物素標記的dNTP插入到缺口的3`端1）切口平移標記法第22頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2）隨機引物法（randompriming）以6~8個核苷酸長的序列隨機的寡核苷酸作為引物，在Klenow片段作用下，加入帶有標記的dNTP進行隨機擴增，即可形成放射性同位素標記的DNA探針。第23頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點：由于隨機引物標記僅僅需要一種酶，比較簡單，條件易于控制，雜交重復性好，所以應用較多。第24頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月末端標記用KlenowDNA聚合酶對DNA的3‘末端進行標記第25頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月用T4多核苷酸激酶標記DNA5ˊ末端

p-CGA……CG-OH

堿性磷酸酶(AKP）OH-CGA……CG-OH[γ-32P]ATPT4噬菌體多核苷酸激酶（PNK）

32P-CGA…….CG-OH第26頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、分子雜交的基本方法Southern雜交Northern雜交Western雜交菌落（噬菌斑）原位雜交斑點雜交第27頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）Southern雜交1975年，英國EdwenSouthern創(chuàng)建檢測DNA雜交方法，即將DNA電泳、轉印到固相支持物上，用探針進行檢測的方法。Southern雜交主要用來判斷某一生物樣品中是否存在某一基因，以及該基因所在的限制性酶切片段的大小。第28頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月關鍵技術1、Southern印跡轉移：核酸樣品在凝膠上進行分離后，通過影印的方式轉移到固相支持物濾膜上的過程。2、分子雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記的DNA/RNA探針進行雜交。因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。第29頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月1、Southern印跡轉移可以通過毛細管虹吸法或電轉移或真空轉移的方式，將凝膠上的DNA轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。最后通過80℃處理或紫外線照射將DNA固定在濾膜上。第30頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月吸水紙毛細管虹吸法Southern轉膜第31頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第33頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2、分子雜交

預雜交

將結合了DNA分子的濾膜先與特定的預雜液進行預雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附。雜交

在一定的溶液條件和溫度下，將標記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上。洗膜

經(jīng)過一定的洗滌程序將游離的探針分子除去。

第34頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月1.待測DNA樣品的制備、酶切2.待測DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳3.凝膠中DNA的變性：堿變性4.Southern轉膜(印跡)：毛細管虹吸印跡法、電轉移法、真空轉移法5.Southern雜交(預雜交、雜交、洗膜)6.雜交結果的檢測：放射性自顯影/生化檢測Southern雜交流程總結第35頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNA

DNA限制片段

硝酸纖維素濾膜

同探針同源雜交的基因DNA片段

X光底片

Southernblotting第36頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月Southernblot的結果SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。ABCDEFGHIJKL第37頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）

Northern雜交檢測特定RNA（主要是mRNA）分子的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳:變性凝膠電泳應用：檢測在轉錄水平某基因是否表達第38頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）Western雜交蛋白雜交/蛋白質的免疫印跡檢測蛋白質，即將電泳分離的蛋白質轉移到固相載體上，通過抗體以免疫反應形式檢測濾膜上是否存在被抗體識別的蛋白質，并判斷其分子量。所用的探針不是DNA或RNA，而是針對某一蛋白質制備的特異性抗體。第39頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月主要步驟蛋白質樣