基因組的提取及電泳鑒定

基因組的提取及電泳鑒定第1頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗課考試1.最后2學時進行實驗課考試

2.開卷,內容為實驗課學習內容。

第2頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、加樣器的使用及注意事項1、用途2、如何使用？2.1根據取樣量，選擇合適的加樣器。5ul、50ul、500ul，應選擇哪個加樣器?頂部標有加樣器的最大量程，分別為：20ul:

0.5~20l100/200ul:20~100/200l1000ul:200ul~1000l實驗儀器的使用及注意事項第4頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月練習：加樣器讀數為100，實際體積各為多少?2.2如何調節(jié)？(1)首先觀察目前讀數,假設為050:1000l:500l100/200l:50l20l：5l

(2)順時針調節(jié)---讀數變小逆時針調節(jié)---讀數變大(3)注意：調節(jié)前加樣器讀數正處于最大量程或最小量程時，如果向錯誤方向調節(jié)，馬上會超出量程，將會損害加樣器的精度。第5頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.3加樣器使用步驟(示教及學生練習)：1）選擇加樣器,觀察讀數,調節(jié)讀數，吸頭的安裝要緊密。

不要用手直接拿吸頭，安上吸頭后一定要再固定一下。2）吸取液體前，先打到第一擋。3）將吸頭插入液面下適當深度，過深可能會腐蝕加樣器,過淺可能會吸入空氣。4）緩慢松開拇指,吸取液體。松開過快，液體上沖會腐蝕加樣器;完全放開拇指后，停留約半秒鐘,急于離開液面，容易吸入空氣。5）抬起加樣器,估計體積是否正確,將外壁液體用容器口引流回去6）(吸頭內有液體時，不能將加樣器倒置或平放，以防液體倒流損壞加樣器！),貼容器內壁，將液體勻速打出，加樣器推到第二擋。觀察吸頭內液體是否完全打出并立即棄于廢物盒內.第6頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、打開電源2、離心管中的液體為2/3,蓋緊蓋子,防止離心機被腐蝕。二、離心機的使用注意事項1代表轉速盤上方的數據，2代表下方的數據。3、樣品配平,對稱放入離心機(管的連接處朝外).4、設定離心時間(如設定2分鐘，可定時多點時間，再用手表記時)。5、統(tǒng)一離心，逐漸升到要求轉速。第7頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗一、

真核細胞基因組DNA的

提取、酶切及電泳實驗目的1.掌握人外周血基因組DNA的提取技術。

2.學習酶切技術3.學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和技術。第一部分：裂解血細胞、蛋白酶k消化第二部分:酚氯仿抽提、乙醇沉淀第三部分：酶切、DNA電泳實驗內容（到8：30~8:40）第8頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

1）取0.3ml抗凝血置于1.5mlEppendorf管中.2）加入1mlSTMT溶液，充分混勻，靜置5min，使其溶血。3）9,000rpm,離心3分鐘(統(tǒng)一離心)。4）棄上清。彈管底重懸沉淀。注意:離心時離心機內樣品要平衡

實驗步驟實驗第一部分：裂解紅細胞、蛋白酶K消化8：40~9：15

STMT溶液：S:Sugar8%T:TritonX-1001%

M:MgCl20.5mMT:Tris-HCl10mM(PH:8.0)

作用：用Triton細胞膜上打孔，裂解細胞。第9頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月4）加0.4ml生理鹽水，懸浮細胞。5）9000rpm,離心3分鐘(統(tǒng)一離心)，棄上清，彈勻。6）加460lNE溶液，混勻。7）加30l10%SDS,迅速混勻。8）加50l蛋白酶K(20mg/ml),混勻，

置50°C水浴1小時。操作注意事項：1、混勻時確認沉淀已被懸起。2、注意30ul、50ul加樣體積準確。第10頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月作用：a.陰離子型去污劑，溶解細胞膜、核膜上脂質成分

b.使蛋白質變性

c.將細胞膜、核膜破壞；對核酸酶有抑制作用N:NaCl50mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)作用：金屬離子螯合劑，抑制DNase的活性(螯合DNase發(fā)揮活性所需的2價陽離子)。各種試劑的作用1、NE溶液：2、SDS：十二烷基硫酸鈉終濃度0.5%3、蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶)是廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白質，將DNA游離。第11頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月一、核酸提取的主要步驟課間介紹真核細胞基因組在提取過程中一般有以下幾步:1)破碎細胞；2)去除蛋白質，糖類等等生物大分子；由于真核細胞基因組較大，在純化出的ＤＮＡ的操作中應注意動作輕柔，且在低溫下進行，以最大限度地減少機械和化學作用對ＤＮＡ的剪切，從而獲得相對完整的ＤＮＡ3)沉淀核酸第12頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月乙醇沉淀SDS裂解蛋白酶K消化瓊脂糖電泳PCRDNA提取步驟圖解酚氯仿抽提第13頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月重蒸酚:

酚的作用是變性蛋白質，而對DNA結構沒有影響。無色酚的氧化產物(如醌等,粉紅色)破壞磷酸二脂鍵。重蒸酚是將酚中的酚的氧化產物去除。TE溶液:

Tris-HCl10mM(pH:8.0)EDTA.Na21mM(pH:8.0)

作用：提供略堿的pH值，保證DNA溶于水相。在酸性條件下，DNA分配于有機相。8-羥基喹啉：

0.1%黃色酚相指示劑抗氧化劑作用：去除蛋白等雜質。酚對蛋白有強烈的變性作用，用酚和氯仿抽提樣品，可以使樣品中的蛋白質變性沉淀，可通過離心去除。為防止其對后續(xù)實驗的影響，一般再用氯仿抽提去除殘留的酚。1、TE飽和重蒸苯酚：第14頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月氯仿作用：

a.氯仿的變性作用不如酚好，

但與酚共同/交替使用可增強去蛋白效果；b.氯仿有加速有機相和水相的分離、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；2、酚/氯仿3、氯仿/異戊醇(24:1)氯仿的作用：去除DNA水溶液中殘留的微量酚。異戊醇的作用：減少操作過程中氣泡的產生。第15頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月在單價陽離子存在的情況下，乙醇可以使DNA發(fā)生沉淀?？呻x心收集

.核酸是多聚陰陽離子的水溶性化合物，能與很多陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機溶劑中不溶解，也不會被變性。最常用沉淀劑為1價鈉、鉀、胺和鋰等離子的鹽類，如醋酸鈉、NaCl、氯化鋰、氯化鉀等常用有機沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二醇、精胺等。5、無水乙醇：作用：提供單價陽離子。4、醋酸鈉：3MNaAcpH:5.2第16頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月課間休息同學自己練習：加樣器使用提示：

（1）吸頭的安裝要緊密。（2）打到第一擋，將吸頭插入液面下適當深度（3）緩慢松開拇指，吸取液體。拇指完全放開后，吸頭在液面下停留一下（約半秒鐘）（4）將外壁液體用容器口引流回容器。吸頭內的體積應大致正確。（5）貼目的容器內壁，將液體勻速打到目的容器內，加樣器推到第二擋。觀察吸頭內液體是否完全打出。十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS)等離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。蛋白酶K,再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得總DNA溶液。10:00上課第17頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1、加入550ul(等體積)TE飽和酚,混勻1min.10,000rpm,2min。

(注意抽取下層酚相;酚可腐蝕加樣器等,加樣器頭用過即棄掉)

(輕柔混勻，避免DNA鏈斷裂;但是太輕又起不到變性蛋白的作用)

2、將上層水相移至一新管中

(要盡量抽盡，又不可吸起酚相)。加入500ul(等體積)酚/氯仿(已經配好，體積比1:1),

同上條件混勻、離心。3、將上層水相移至一新管中。加入500ul(等體積)氯仿-異戊醇，同上條件離心、取上清。4、加入1/10體積（約30ul）醋酸鈉于上清中充分混勻。加入2-2.5倍體積無水乙醇（約1ml）

（通常加滿小離心管），

混勻后交給老師，（統(tǒng)一置）-20℃1h(或-70℃

10min)。實驗第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀第18頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月乙醇沉淀后午休。注意事項：1）本實驗將用到的TE飽和重蒸苯酚、氯仿/異戊醇是有機試劑，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我們總是取上清。2）在抽取完苯酚、氯仿等有機試劑，不能將加樣器平放或倒置，以防液體導流損壞加樣器，加完樣后立即棄掉加樣器頭。3）

基因組DNA由于太大，非常容易受機械剪切而斷裂，因此，為了得到完整的基因組DNA，盡量不要多次進行物理性操作。第19頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月7、加入13l

雙蒸水,溶解沉淀，-20℃保存。

6、10,000r/min離心5min，棄上清。8l：酶切、電泳余5l：PCR模板（下次課進行）。藍頭黃頭濾紙條(吸干內壁液體)觀察DNA沉淀的顏色。一定要充分溶解沉淀第20頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月8、基因組DNA的酶切：基因組DNA8ul

10xBufferH1ul

EcoRI(最后加入)0.6ul

置37℃保溫45min。實驗第三部分：基因組DNA的酶切1:00~2:20第21頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月課間介紹（2）：1.酶切相關知識1、酶活性單位Unit（U）：

1U:是指在1小時內，適當溫度下(37°C)，在50ul

反應體系中，將1ugoflambdaDNA(底物DNA)完全消化所需的酶量。2、酶切體系：

10×反應緩沖液：提供內切酶反應最適pH值及所需離子。

雙蒸水：無細菌和其他酶類污染。

BSA：100-200ug/ml，保護酶蛋白不失活。內切酶：含50%甘油，-20℃保存。反應體積：一般根據底物DNA的量來計算。反應體系中甘油濃度應<5%。

第22頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1.Southernblot

DNA水平基因結構分析的重要策略之一.

基因組DNA酶切電泳后可以直接用于Southernblot轉膜。2.構建基因組文庫3.PCR的模板

克隆表達基因

分析基因一級結構的變化基因組PCR產物的酶切電泳可以分析基因多態(tài)性；利用內參法可以相對定量分析特定基因在基因組上的拷貝數。課間介紹

提取模板DNA的常見目的：基因組DNA的鏈很長，常用的蛋白酶K酚抽提法由于機械剪切力的作用，很難獲得完整的DNA分子,可獲得100kb-150kb大小的DNA片斷，可滿足下述實驗用途。第23頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA瓊脂糖凝膠電泳1.內切酶消化后的DNA片段瓊脂糖凝膠取下硝酸纖維素膜標記探針雜交袋4.將硝酸纖維素膜放入雜交袋中,預雜交;雜交:與標記的核酸探針;洗膜放射自顯影后的X光底片將硝酸纖維素膜與X-光片曝光2.變性中和3.轉膜5.放射自顯影或顯色Southern

Blot基本過程第24頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗第四部分、DNA質量檢測－－－瓊脂糖電泳一、原理

DNA分子在pH8.0的電泳環(huán)境中，帶負電荷，在一定強度電場力的作用下，從負極向正極遷移。電泳樣品載體瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，煮沸冷卻后形成網格樣結構，電泳中起分子篩作用。通常情況下，分子量大的DNA電泳過程中由于受到的阻力較大，泳動速率較慢，反之，分子量較小的DNA片段跑在前面。第25頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月二、常用試劑上樣液成份：

1．0.25%溴酚藍或/和0.25%二甲苯青（樣品指示劑）2．40%蔗糖或30%甘油（增加樣品比重），利于加樣。電泳緩沖液：

TAE為例

T:Tris堿A:冰醋酸E:EDTA

提供有一定緩沖能力的pH值(8.0),EDTA可抑制DNase的作用。溴化乙錠（EB）：染色劑一種熒光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA的堿基之間。在紫外光激發(fā)下能發(fā)出紅色的熒光。致癌劑第26頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1%瓊脂糖凝膠電泳。在樣品中加2～3ul6×上樣液，混勻，加入上樣孔內．電泳條件：100