氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒(DTNB速率微板法)

氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒(DTNB速率微板法)簡介：谷胱甘肽(glutathione,GSH)存在于幾乎身體的每一個細(xì)胞，參與細(xì)胞許多功能活動，是一種氧自由基消除劑。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)，故常簡寫為G-SH或GSH，易與某些藥物(如撲熱息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、鉛、汞、砷等等結(jié)合，具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有廣譜解毒作用，在延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用。谷胱甘肽是研究活性氧和自由基的重要指標(biāo)，亦是機(jī)體氧化物牽累的重要指標(biāo)。還原型谷胱甘肽(GSH)是一種含y酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，能可逆的轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰?GSSG)，其存在形式會隨著細(xì)胞內(nèi)代謝的情況而發(fā)生相互轉(zhuǎn)變。氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒(DTNB速率微板法)(GSSGAssayKit)是一種簡單易行的氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測的試劑盒，其檢測原理是先檢測還原型谷胱甘肽(GSH)含量，再檢測總谷胱甘肽(T-GSH)含量T-GSH減去GSH即得氧化型谷胱甘肽(GSSG):待測樣品中的還原型谷胱甘肽(GSH)與發(fā)色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定黃色的TNB和GSSG；谷胱甘肽還原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，由GSSG還原成的GSH和樣品本身含有的GSH都與發(fā)色底物DTNB反應(yīng)，生成黃色的TNB和GSSG，前后兩個反應(yīng)合并起來，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當(dāng)于一個呈色的限速反應(yīng)，總谷胱甘肽(T-GSH)含量決定了黃色含量。通過分光光度法(酶標(biāo)儀)檢測處吸光度，與相應(yīng)處理的GSH標(biāo)準(zhǔn)比較，分別獲得還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)，用T-GSH減去GSH即得氧化型谷胱甘肽(GSSG)。該試劑盒可用于檢測血漿、血清、組織、細(xì)胞等樣品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，亦可檢測還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)含量。該試劑盒僅用于科研，不用于臨床診斷或其他用途。名稱編號TO1042100TStorage試劑(A):還原型谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)10mg4°C避光試劑(B):GSHassaybuffer100mlRT試劑(C):DTNB10mgRT避光試劑(D):蛋白沉淀劑1gRT避光試劑(E):NADPH10mg-20C避光試劑(F):DMSO1.5mlRT避光試劑(G):ddH2O50mlRT避光

試劑(H):GSH還原酶原液15pl-20C避光使用說明書1份自備料：1、 離心管或小試管2、 蒸餾水3、 離心機(jī)4、 水浴鍋5、 96孔板6、 酶標(biāo)儀或生化分析儀操作步驟(僅供參考):1、 配制GSH標(biāo)準(zhǔn)儲存液：取還原型谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)加入ddH2O，溶解并混勻，即為還原型GSH標(biāo)準(zhǔn)儲存液(1OmM)。一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20弋保存。2、 酉己制DTNB儲存液:在本試劑盒提供的DTNB中加入DMSO,溶解并混勻很卩為DTNB儲存液(10mg/ml)。一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20^保存。3、 酉己制50xGSH還原酶：按GSH還原酶原液：GSHassaybuffer混合，即為50xGSH還原酶。-20°C保存，3個月有效。4、 酉己制GSH檢測工作液：按下表配制GSH檢測工作液。1個樣品10個樣品50個樣品GSHassaybuffer0.2ml2ml10mlDTNB儲存液2.5pl25pl125pl5、酉己制T-GSH檢測工作液：按下表配制T-GSH檢測工作液。1個樣品10個樣品50個樣品GSHassaybuffer0.2ml2ml10mlDTNB儲存液2.5pl25pl125pl50xGSH還原酶5.4pl54pl270pl6、 酉己制蛋白沉淀工作液：在本試劑盒提供的蛋白沉淀劑中加入ddH2O,配制成的水溶液，即為蛋白沉淀工作液，4C保存。7、 配制標(biāo)準(zhǔn)品：把還原型GSH標(biāo)準(zhǔn)儲存液(10mM)用蛋白沉淀工作液稀釋成50pM標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后依次稀釋成25、15、10、5、2pMGSH溶液。取50、25、15、10、5、2pMGSH標(biāo)準(zhǔn)溶液6個點做標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：由于GSH標(biāo)準(zhǔn)在蛋白沉淀工作液中不

太穩(wěn)定，用蛋白沉淀工作液配制的GSH溶液必須新鮮配制后使用，不可凍存后再使用。8、 酉己制NADPH工作液：在本試劑盒提供的10mgNADPH中加入1mlddH2O，溶解并混勻，即為NADPH儲存液(10mg/ml)。一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20弋保存。取按NADPH儲存液(10mg/ml)加入GSHassaybuffer,充分混勻，即為NADPH工作液(0.12mg/ml)。9、 準(zhǔn)備樣品：紅細(xì)胞或血漿樣品的制備：請盡量使用新鮮的血液進(jìn)行測定。離心，沉淀為紅細(xì)胞，上清為血漿。對于紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。取約紅細(xì)胞沉淀或血漿，加入蛋白沉淀工作液，充分Vortex振勻。4弋或冰浴放置10min,4弋，離心，取上清用于還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)測定，樣品需暫時4弋保存?zhèn)溆?，不立即測定的樣品可以-70弋保存，但不宜超過10天。對于處理好的紅細(xì)胞樣品最后需用蛋白沉淀工作液稀釋10倍后再進(jìn)行后續(xù)的測定，而對于血漿樣品，應(yīng)直接取進(jìn)行測定。組織樣品的制備：取組織用液氮速凍，迅速研磨，按每50mg加入蛋白沉淀工作液，充分Vortex振勻。再加入350pl蛋白沉淀工作液，用勻漿器充分勻漿。4弋孵育，離心，取上清用于還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽仃-GSH)測定。樣品需暫時4弋保存?zhèn)溆?，不立即測定的樣品可以-70弋保存，但不宜超過10天。對于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定，細(xì)胞樣品的制備：PBS洗滌細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入蛋白沉淀工作液，充分Vortex振勻。(收集細(xì)胞前后分別對離心管進(jìn)行稱重，從而就可以計算出細(xì)胞沉淀的重量，10mg細(xì)胞沉淀的體積可以粗略地看做10ml。)對樣品進(jìn)行快速的凍融后，4弋或冰上孵育5min。離心，取上清用于還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)測定。樣品需暫時4°C保存?zhèn)溆?，不立即測定的樣品可以-70弋保存，但不宜超過10天。對于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。10、 GSH加樣操作：取96孔板，按照下表設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的GSH濃度過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。加入物Wl)空白孔標(biāo)準(zhǔn)孔測定孔蛋白沉淀工作液10————系列標(biāo)準(zhǔn)品(2~5O|JM)——10——待測樣品————10GSH檢測工作液200200200室溫或25°C孵育5min。

NADPH工作液(0.12mg/ml)50505011、T-GSH加樣操作：取96孔板，按照下表設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中T-GSH濃度過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。加入物Wl)空白孔標(biāo)準(zhǔn)孔測定孔蛋白沉淀工作液10————系列標(biāo)準(zhǔn)品(2~50pM)——10——待測樣品————10T-GSH檢測工作液200200200室溫或25°C孵育。NADPH工作液(0.12mg/ml)50505012、GSH和T-GSH檢測：立即用酶標(biāo)儀或自動生化分析儀于處每隔檢測一次，空白孔調(diào)零，共檢測6min(亦可加入NADPH工作液反應(yīng)6min后檢測，只檢測1次)，以檢測其反應(yīng)速率△A/min。如果酶標(biāo)儀不能檢測410nm,可測定405-420nm處吸光度。計算：動力學(xué)測定法：根據(jù)不同時間點測定得到的吸光度值計算出AA410/min，以GSH標(biāo)準(zhǔn)的濃度(50、25、15、10、5、2pM)為橫坐標(biāo)，以AA^/min為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測的AA410/min，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計算出測定時樣品還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。GSSG含量二總谷胱甘肽(T-GSH)的含量-還原型谷胱甘肽(GSH)含量動力學(xué)法測定結(jié)果比終點測定法的結(jié)果精確。根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最初樣品的使用量，可以計算出每毫克組織或細(xì)胞中的總谷胱甘肽的含量，通過測定蛋白濃度，從而計算出樣品的蛋白量，最后計算出每mg蛋白中還原型谷胱甘肽的含量。終點測定法：即反應(yīng)6min僅測定1次吸光度。以GSH標(biāo)準(zhǔn)的濃度(50、25、15、10、5、2pM)為橫坐標(biāo)，以AA410/min為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出總谷胱甘肽的含量。終點測定法比動力學(xué)法快捷。根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最

初樣品的使用量，可以計算出每毫克組織或細(xì)胞中的總谷胱甘肽的含量，通過測定蛋白濃度，從而計算出樣品的蛋白量，最后計算出每mg蛋白中還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。GSSG含量二總谷胱甘肽(T-GSH)的含量-還原型谷胱甘肽(GSH)含量參考區(qū)間：成年全血GSH成年全血GSH1.02±0.17mmol/L注意事項：1、 GSH比較穩(wěn)定，血液樣品以ACD抗凝后冰箱4弋保存，3~4周內(nèi)穩(wěn)定。2、 請盡量使用新鮮的細(xì)胞進(jìn)行測定，而不要使用凍存的細(xì)胞進(jìn)行測定，避免使酶活性下降。3、 全血G