具可靠性的實(shí)驗(yàn)室分析結(jié)果和有實(shí)行可能的程序

01.2具可靠性的實(shí)驗(yàn)室分析結(jié)果和有實(shí)行可能的程序姓名：徐郁雯有效的分析結(jié)果和價(jià)值決定于分析過(guò)程之可靠性及可實(shí)行性。根據(jù)定義1（1980,IFCC），分析的可靠性決定于方法的正確、精密、專(zhuān)一性和可探測(cè)性。這些標(biāo)準(zhǔn)的大綱及細(xì)節(jié)被列在table1。一個(gè)方法是否可行決定于它的速度、花費(fèi)、專(zhuān)業(yè)技術(shù)的需求及可靠性（亦即機(jī)械和電子的可靠性是由它們的技能所決定）。分析家考慮以下這些方面：他一定會(huì)從好的定義程序獲得訊息，而這段章節(jié)的目的是指引讀者養(yǎng)成從一般已知的程序中，培養(yǎng)選擇研究方法的判斷力。分析化學(xué)得判定結(jié)果是由分析結(jié)果的價(jià)值及考慮其應(yīng)用結(jié)果來(lái)判定（例如：在工業(yè)上，程序的控制必須執(zhí)行對(duì)質(zhì)量的要求；在臨床科學(xué)上，疾病的診斷和治療是由診斷結(jié)果來(lái)決定；在食品化學(xué)方面，評(píng)定食品給人體的營(yíng)養(yǎng)是利用分析的方法；在法律科學(xué)，法官的結(jié)論及其他的調(diào)查都必須采用許多分析結(jié)果的報(bào)告）。同樣地，它們?cè)诨瘜W(xué)分析的花費(fèi)都是不可被忽略的。在不考慮花費(fèi)的情況下，可靠性及可實(shí)行性也有可能會(huì)沖突，一般而言，許多可靠的實(shí)驗(yàn)都會(huì)從事這種復(fù)雜的分析過(guò)程。從實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果可能會(huì)把實(shí)驗(yàn)和程序處理分開(kāi)，實(shí)驗(yàn)的部分可以進(jìn)一步細(xì)分成預(yù)先分析程序（亦即實(shí)驗(yàn)步驟和準(zhǔn)備樣品）以及分析步驟。而分析的部分是由描述方法、試劑和媒介所組成，而每一個(gè)形式都是分析的重要部分。而數(shù)據(jù)處理就是計(jì)算從儀器輸出的最終結(jié)果，只要能夠在國(guó)際認(rèn)同的質(zhì)量級(jí)單位下標(biāo)準(zhǔn)化即可，亦即SIunits。1.2.1有效方法的專(zhuān)有名詞像是正確和精確這些術(shù)語(yǔ)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中流傳很久，有些常使用的字，它們?cè)诓煌沫h(huán)境或?qū)懛ㄏ聲?huì)有不同的意思。于是產(chǎn)生新的需要，成為國(guó)際允許的定義（forreferencecf.）。在這本書(shū)里我們用table1來(lái)做簡(jiǎn)要的說(shuō)明。Table1.名詞的定義標(biāo)準(zhǔn)定義精確與重復(fù)測(cè)度大小一致，它沒(méi)有數(shù)字值。不精確標(biāo)準(zhǔn)偏差或是一組重復(fù)測(cè)度近似標(biāo)準(zhǔn)偏差。這是用來(lái)說(shuō)明這些重復(fù)測(cè)度的量和其目的的描述（在一天之內(nèi)、在一天之間、在實(shí)驗(yàn)室之間）可再生性精確值是連續(xù)性的專(zhuān)一性需要用特定一種分析技術(shù)才能測(cè)量出其特殊的組成正確指符合最好的估計(jì)量以及它的”真實(shí)值”。它并沒(méi)有數(shù)字值不正確指一組重復(fù)測(cè)度與它的”真實(shí)值”有數(shù)字上的不同，這些不同（正值或負(fù)值）可能會(huì)用已測(cè)量質(zhì)量的單位來(lái)表現(xiàn)，或當(dāng)成一個(gè)”真實(shí)值”的百分比。偏差組織的錯(cuò)誤可探測(cè)性（常用來(lái)指敏感度，但在不同的范圍會(huì)有不同的組成）可以利用特定一種方法能夠去探測(cè)其小質(zhì)量的組成。它沒(méi)有數(shù)字值。探測(cè)界線清楚地發(fā)現(xiàn)一個(gè)最小且不同于背景的結(jié)果；像是三個(gè)特定的標(biāo)準(zhǔn)偏差在空白的價(jià)值中被定義敏感度（特殊的可能性）一個(gè)特定的方法能夠去分別濃度和容量的些微差異。1.2.1.1精確/不精確精確的測(cè)量是指與重復(fù)測(cè)度的大小一致，它沒(méi)有數(shù)字值。雖然這個(gè)定義看似清楚，但仍然有些許的混亂在不精確（隨機(jī)的錯(cuò)誤）的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取方法上。測(cè)量的數(shù)據(jù)分散的程度可以被計(jì)算出來(lái)；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（關(guān)于主要的值）sx/x指出字面上的不精確。不精確粗略地符合形式上表達(dá)的多樣性及分析的多變性。特別是在臨床化學(xué)上，不精確就是指變化系數(shù)（C.V.），它的單位是百分率。當(dāng)然這是誤用”coefficient”這個(gè)名詞，正確的意思是暗示一個(gè)因子其基礎(chǔ)的單位增加：例如：反應(yīng)速率的溫度系數(shù)是一個(gè)增加反應(yīng)速率的因素，也可以用來(lái)得到其他測(cè)量溫度的值。例如一個(gè)反應(yīng)速率在20℃是100/S且在21℃是102/S，所以這個(gè)溫度的系數(shù)是1.02/K，而不是2﹪，來(lái)代替變化系數(shù)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）是從想要的值所獲得。在”精確”的概念中，我們必須區(qū)分在連續(xù)范圍內(nèi)的精確值，以及連續(xù)或逐日（reproducibility）的精確值，還有實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)室間（長(zhǎng)時(shí)間的精確值）；可參考Vol.=2\*ROMANII,chapter3.2.1.1。在大部分的情況下，試劑的和樣品的體積大小是導(dǎo)致不精確的主要原因。吸量的錯(cuò)誤是由于沒(méi)有測(cè)量吸量管的口徑或是配藥者對(duì)實(shí)驗(yàn)室配備的影響（table2）。這是明顯的錯(cuò)誤但大部分的人都會(huì)忽略，樣品的精確測(cè)量將左右樣品的分析結(jié)果，反而吸量管中小體積的誤差是可以被忽略的。減少使用吸量管可因此降低它的不精確，一個(gè)預(yù)先混合好的藥劑應(yīng)該更符合使用。其他的錯(cuò)誤來(lái)源是在催化酵素的時(shí)候使用不適當(dāng)?shù)难b置或溫度控制，還有不精確的試管，對(duì)偶的實(shí)驗(yàn)，指示器的不正確率和輔酵素對(duì)主酵素影響的測(cè)量（c.fchapter2.3.3.4）。不精確的食物酵素分析數(shù)據(jù)可根據(jù)E.Gomboczetal.(3)Table2吸量的錯(cuò)誤和影響SolutionVolume(ml)ProtocolpipettedVolumeerrorerrorinmeasuredresult（mol/l）Buffer1.001.09+9﹪+3﹪Coenzyme0.100.15+15﹪+0.05﹪Sample0.100.12+20﹪+20﹪Water1.601.45-10﹪-5﹪Enzyme0.200.40+100﹪*+6.7﹪Grosserrors（wrongpipette）1.2.1.2正確/不正確正確的大小定義為符合最好的估計(jì)量和它的”真實(shí)值”，它并沒(méi)有數(shù)字值。圍繞在真實(shí)值附近的測(cè)量數(shù)據(jù)和位置可以被描述出來(lái)；而相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)真實(shí)值而言是不正確的（組織的錯(cuò)誤，歪斜）。不正確的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)方法在與參考文獻(xiàn)還有真實(shí)值的比較下產(chǎn)生偏差結(jié)果。不正確的方法決定于它的專(zhuān)一性，還有樣品的其他組成之干擾（例如：生理地和病理的代謝，以及血漿中的藥劑）。因此，正確的酵素使用方法決定于酵素使用時(shí)的活性及專(zhuān)一性，還有它的純度。這三個(gè)可變因子是不能被分開(kāi)的，因?yàn)樗鼈儠?huì)互相影響（seeVol.=2\*ROMANII，chapter2.1.2）。某部分的活性會(huì)帶領(lǐng)反應(yīng)完成因此應(yīng)避免因缺乏酵素而恢復(fù)。一個(gè)酵素的專(zhuān)一性是指酵素只能靠一特定的基質(zhì)來(lái)轉(zhuǎn)換，其他相似的化合物則不行（像是同質(zhì)體）。在代謝的分析中，專(zhuān)一性的需求具有特殊的重要性。雖然某些酵素顯示出”族群專(zhuān)一性”，例如：某些特定的物質(zhì)可以利用與其他非專(zhuān)一性的酵素結(jié)合來(lái)完成其專(zhuān)一性（例子：決定葡萄糖和非專(zhuān)一性hexokinase會(huì)變成專(zhuān)一性是由于指示酵素glucose-6-phosphatedehydrogenase）。雜質(zhì)是指準(zhǔn)備的酵素中包含污染的酵素或是其他的副產(chǎn)物，（參考Vol.=2\*ROMANII，chapter2.1.2）非專(zhuān)一性和雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致樣品中某些化合物同時(shí)轉(zhuǎn)換，使用高質(zhì)量的酵素，可以在相同的試管中利用恢復(fù)大小來(lái)探測(cè)錯(cuò)誤的結(jié)果。1.2.1.3探測(cè)的界線與敏感性在程序中的分析界線是被單一個(gè)最小的結(jié)果在可能性的狀態(tài)下所指示，它能從一個(gè)適當(dāng)?shù)目瞻字斜粎^(qū)分出來(lái)。分析的界線為一濃度或數(shù)量和界線點(diǎn)是合理的(4)，也可以討論文獻(xiàn)(5)、(6)。一般而言，大多數(shù)判定酵素的方法和酵素活性的測(cè)量有足夠地探測(cè)界線，請(qǐng)看Table3.Table3.酵素的探測(cè)界線測(cè)量方法樣品中的探測(cè)限制（大約地）mol/l測(cè)光法終點(diǎn)法10－6~10－5動(dòng)力法10－7~10－6催化法10－9~10－8測(cè)熒光法終點(diǎn)法10－9~10－8酵素循環(huán)10－15~10－14測(cè)照度法10－13~10－8酵素免疫分析異質(zhì)10－12~10－10同質(zhì)10－5~10－10敏感度這個(gè)名詞大部分使用在不正確的方法上，它并不是指測(cè)量最低可能的界線；而是被探測(cè)界線所覆蓋。敏感性最好用來(lái)指一個(gè)分析方法中的特殊可能性「7」，它能夠使一個(gè)方法在低濃度的層面下去區(qū)分某些小濃度不同的重要性。然而，還沒(méi)有國(guó)際允許的定義被創(chuàng)造出來(lái)。測(cè)量工具的質(zhì)量可以決定好的敏感度，’當(dāng)獲得敏感度的數(shù)據(jù)時(shí)，我們應(yīng)該提到儀器的大小還有其他情況。1.2.1.4可實(shí)行性，方便假如一個(gè)具可靠性的方法被確信，好的可行性，單一性和方便性是由以下這兩個(gè)理由來(lái)尋找：在例行的工作上節(jié)省時(shí)間，降低步驟的次數(shù)以盡可能減少來(lái)源的錯(cuò)誤。程序的機(jī)械化是單一化的一種。1.2.2獲得高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的概念當(dāng)我們?cè)谧鰯?shù)量分析的時(shí)候，為了得到高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們一定要注意分析過(guò)程的四個(gè)部分：1.在進(jìn)行分析的時(shí)候，要清楚的書(shū)寫(xiě)所有的步驟。2.選擇可以應(yīng)用的儀器和技術(shù)。3.注意分析的藥劑。4.人員訓(xùn)練的執(zhí)行。而在方法步驟中，我們必須區(qū)別出以下的6個(gè)過(guò)程：1.取樣。2.準(zhǔn)備樣品時(shí)要注意輸送的過(guò)程中保持其生理和化學(xué)的活性。3.測(cè)量想要的樣品成分。4.輸出測(cè)量的結(jié)果。5.測(cè)試結(jié)果是否可取。確認(rèn)結(jié)果。這6個(gè)步驟可能會(huì)影響分析結(jié)果的正確性，所以我們必須控制整個(gè)性統(tǒng)的質(zhì)量，并盡可能減少程序上的錯(cuò)誤。1.2.3方法的選擇、設(shè)計(jì)及儀器的使用我們必須在方法取得之前確保分析結(jié)果的價(jià)值，為了確定分析方法能的到有價(jià)值的結(jié)果，所以必須考慮不同的步驟（table4）Table4.獲得有價(jià)值的分析結(jié)果之步驟StepA定出分析的問(wèn)題產(chǎn)生數(shù)據(jù)的必要條件－分析的質(zhì)量－反應(yīng)速度－有效率地完成分析－產(chǎn)生數(shù)據(jù)的花費(fèi)StepB選擇方法和使用儀器B1－方法的選擇和使用儀器－可能的分析原理－在StepA下，以需求來(lái)分析原理－反應(yīng)情況的產(chǎn)生－藥劑的規(guī)定和程序的可實(shí)行性、計(jì)算等…B2方法的評(píng)估－評(píng)估分析的可靠性（正確、精確、專(zhuān)一和探測(cè)性）－評(píng)估方法的可行性B3寫(xiě)出流程B4選擇儀器－與選擇的方法一致－與實(shí)驗(yàn)室的需求一致]StepC方法的開(kāi)始和保持C1開(kāi)始的必要條件－人員的訓(xùn)練－技術(shù)和藥劑的獲得C2持續(xù)－過(guò)程及產(chǎn)物的控制（要控制系統(tǒng)在最適宜的情況下）－每逢系統(tǒng)發(fā)出訊號(hào)時(shí)要做正確的測(cè)量1.2.3.2選擇方法選擇或產(chǎn)生一個(gè)方法：測(cè)量酵素活性（Fig1）選擇或產(chǎn)生一個(gè)方法：藥劑的標(biāo)準(zhǔn)化，研究方法的細(xì)節(jié)之定義（Fig2）選擇或產(chǎn)生一個(gè)方法：有效的方法（Fig3）選擇測(cè)量基質(zhì)濃度的方法在決定代謝物明確的途徑及酵素活性之后才能描述出所有的流程，然而決定性的方法或是參考用的方法則是尤其可獲得的價(jià)值來(lái)決定，其定義如下：決定性的方法：在排除不適當(dāng)或不正確的方法后所得的結(jié)果。參考的方法:與不正確的方法比較過(guò)后可使用的方法。真實(shí)值：不用定義就能清楚表達(dá)的名詞。決定值：用最后決定的方法所獲得的值稱(chēng)之。參考方法值：由參考方法所獲得的可能結(jié)果之?dāng)?shù)值。分配值:由事先的數(shù)據(jù)或個(gè)別的集合所獲得之值。以下是由不同的方法得到的值方法值－真實(shí)值決定的方法決定值參考的方法參考值方法有已知的偏差分配值方法有未知的偏差分配值舉膽固醇氧化的例子來(lái)說(shuō)：cholesterol+O2－＞Δ4-cholesten-3-one+H2O2不管cholesterolesters的皂化作用，我們可以使用（A.）直接照射UV法，或?qū)ふ乙粋€(gè)特定的指示反應(yīng)。B.催化方法：H2O2氧化甲醇會(huì)形成甲醛，這個(gè)反應(yīng)和醋酸酮會(huì)形成3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidine，可從405nm~415nm的波長(zhǎng)探測(cè)出來(lái)。C.一次過(guò)氧酵素法：H2O2被酚過(guò)氧化酵素和4-aminophenazone(PAP)過(guò)氧化酵素氧化，可由測(cè)量515nm得知。D.二次過(guò)氧化酵素法:指示反應(yīng)是由過(guò)氧化酵素和MBTH(3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone)?？捎蓽y(cè)量600nm得知。精確:這三種不同的方法會(huì)造成些微的差異(seetable7)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在方法C約為0.03，而在其他的方法約為0.05。正確:正確的估計(jì)直是非常廣泛的。膽固醇氧化酵素的專(zhuān)一性并不是絕對(duì)的，他轉(zhuǎn)換7-dehydro-cholestrol和dihydro-cholestrol與某些膽固醇賀爾蒙一樣好。膽固醇的可探測(cè)性并不是一開(kāi)始的重點(diǎn)，它的探測(cè)限制遠(yuǎn)低于血漿的使用。實(shí)行敏感性的方法必須要使用高質(zhì)量的儀器和藥劑區(qū)別不同種類(lèi)的膽固醇，像是游離的膽固醇，酯化的膽固醇以及和脂蛋白結(jié)合的膽固醇。在每一個(gè)事件中都以60個(gè)血漿樣本來(lái)決定其為參考法或偏差的方法，而使用過(guò)氧化酵素和PAP(方法C)可獲得較高的真實(shí)值(Table5)，另外，不精確值也會(huì)隨著膽固醇的升高而降低。生理代謝物的干擾則是研究人體血漿中則是研究人體血漿中其他的物質(zhì)之增加，例如:脂質(zhì)或是尿酸等等…..。有實(shí)行可能性(table6)可能的組成速度，花費(fèi)，方便性吸量步驟的次數(shù)需要去蛋白質(zhì)需要離心需要加熱需要空白需要標(biāo)準(zhǔn)樣品的體積大小測(cè)量口徑的彎曲藥劑的性質(zhì)(b)安全及可靠性1.2.3.3評(píng)估可靠性和可行性一般評(píng)估可靠性的標(biāo)準(zhǔn)都是由IFCC所規(guī)定，所有材料的選擇都是評(píng)估其嘗試后的結(jié)論而定。例如考慮連續(xù)時(shí)間內(nèi).連續(xù)間.每天之間的正確性，或者可能影響儀器或藥劑和處理方式之間的不同。1.2.