細(xì)菌群體感應(yīng)元件構(gòu)建和工程應(yīng)用

群體感應(yīng)現(xiàn)象指的是微生物通過(guò)獨(dú)特的交流方式使不同菌個(gè)體間的行為同步，從而展現(xiàn)群體性行為。當(dāng)前在微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)方面的研究，除了促進(jìn)或抑制天然群體感應(yīng)方面的基礎(chǔ)研究外，研究人員逐漸開(kāi)始將群體感應(yīng)系統(tǒng)引入到合成生物學(xué)的工程應(yīng)用研究，并且將其廣泛運(yùn)用在醫(yī)學(xué)、工業(yè)、環(huán)境等應(yīng)用領(lǐng)域。本文主要總結(jié)了細(xì)菌群體感應(yīng)元件在構(gòu)建過(guò)程中的常用策略與方法，并探討了基于群體感應(yīng)基因元件改造的工程菌在動(dòng)態(tài)代謝調(diào)節(jié)、周期性振蕩呈現(xiàn)、異種菌種間關(guān)系的構(gòu)建等方面的應(yīng)用。群體感應(yīng)元件的研究主要包括新群體感應(yīng)元件的開(kāi)發(fā)和針對(duì)已有群體感應(yīng)元件的優(yōu)化。通過(guò)模擬、優(yōu)化群體感應(yīng)元件并將其模塊化，研究人員構(gòu)建了豐富的群體感應(yīng)基因元件庫(kù)，使群體感應(yīng)能被靈活應(yīng)用于不同場(chǎng)景。另外，通過(guò)在細(xì)菌中引入群體感應(yīng)基因回路，可以將單個(gè)細(xì)菌內(nèi)部的各類反饋回路較好地拓展到整個(gè)細(xì)菌群體中，而這種多細(xì)胞體系的構(gòu)建，使得更多復(fù)雜的功能得以實(shí)現(xiàn)，如通過(guò)群體感應(yīng)實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)代謝調(diào)節(jié)從而提高發(fā)酵效率，或?qū)崿F(xiàn)群體周期性振蕩以釋放腫瘤殺傷藥物等。此外，環(huán)境中異種微生物的關(guān)系也可以通過(guò)外源引入群體感應(yīng)來(lái)進(jìn)行調(diào)控，這為微生物的共培養(yǎng)提供了新工具，更為復(fù)雜的合成生物學(xué)系統(tǒng)的建立提供了新思路。隨著機(jī)器學(xué)習(xí)等計(jì)算機(jī)領(lǐng)域的發(fā)展，未來(lái)可以更多借助計(jì)算機(jī)來(lái)設(shè)計(jì)復(fù)雜群體感應(yīng)回路，并對(duì)外源群體感應(yīng)引入后的效果做出更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)。關(guān)鍵詞：群體感應(yīng);合成生物學(xué);基因元件;微生物;代謝調(diào)控1965年，Tomasz等[1]發(fā)現(xiàn)一種特殊的小分子能夠誘導(dǎo)改變細(xì)菌的群體性行為，這一現(xiàn)象表明細(xì)菌個(gè)體或種群之間可能會(huì)通過(guò)某些特殊的分子實(shí)現(xiàn)內(nèi)部的信號(hào)交流。十多年后，隨著對(duì)費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)自發(fā)產(chǎn)生熒光現(xiàn)象的深入研究，研究人員解析出該菌群內(nèi)部信號(hào)物質(zhì)的分子化學(xué)結(jié)構(gòu)[2]，并鑒定出其相應(yīng)的調(diào)控基因及下游代謝產(chǎn)物[3]，這些研究進(jìn)一步佐證了細(xì)菌種群可利用小分子對(duì)群體行為進(jìn)行調(diào)控的猜想。1994年，群體感應(yīng)(quorumsensing，QS)的概念被Fuqua等[4]首次提出，時(shí)至今日，群體感應(yīng)作為一種重要的基因調(diào)控機(jī)制，已被包括合成生物學(xué)在內(nèi)的生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛研究并運(yùn)用?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為群體感應(yīng)是細(xì)菌通過(guò)自體誘導(dǎo)物(autoinducer)的產(chǎn)生、感應(yīng)和反饋而產(chǎn)生的群體間化學(xué)信號(hào)交流的過(guò)程，它使細(xì)菌能夠根據(jù)種群密度變化和附近細(xì)菌種類組成，同步化群體行為[5]。群體感應(yīng)在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌中有著不同的作用機(jī)理。在革蘭氏陰性菌中，最常見(jiàn)的自體誘導(dǎo)物為AHLs分子，其包含一個(gè)核心的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯環(huán)和一個(gè)被修飾的C~C的酰基418鏈。自體誘導(dǎo)物需進(jìn)入細(xì)菌，與胞內(nèi)的感受器作用，進(jìn)而誘導(dǎo)群體行為變化[6]。而革蘭氏陽(yáng)性菌有兩類主要的群體感應(yīng)自體誘導(dǎo)物：一類是長(zhǎng)鏈或被修飾的肽段，其感受器為細(xì)菌的膜受體；另一類為未被修飾的短肽段[7-8]，可與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的感受器相互作用。感受器位置的差異，可能意味著相應(yīng)群體感應(yīng)機(jī)制具備不同的應(yīng)用場(chǎng)景。群體感應(yīng)效應(yīng)能夠控制同一菌種內(nèi)的多種群體性行為，如毒力因子的分泌[9-11]、生物被膜的形成[12-13]、DNA的轉(zhuǎn)化[14]以及抗生素[15]或抗性的產(chǎn)生[16-17]等。此外，不同菌種的群體感應(yīng)現(xiàn)象也逐步被發(fā)現(xiàn)，研究?jī)?nèi)容涉及自體誘導(dǎo)物的種類、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理[6]和工作距離[18]等。圖1簡(jiǎn)單列舉了群體感應(yīng)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)的一些事件和研究。群體感應(yīng)的提出及研究進(jìn)程群體感應(yīng)的提出及研究進(jìn)程[1-4,15,19-23]Fig.1Researchprogressofquorumsensing[1-4,15,19-23]22群體感應(yīng)系統(tǒng)在構(gòu)建基因回路以實(shí)現(xiàn)不同應(yīng)用時(shí)，天然群體感應(yīng)系統(tǒng)可能由于各種局限性而不能滿足研究人員的需求，因此對(duì)群體感應(yīng)基因模塊的理性設(shè)計(jì)就顯得至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)相關(guān)細(xì)菌基因元件的模擬、優(yōu)化和模塊化，研究人員可以構(gòu)建豐富的群體感應(yīng)基因元件庫(kù)，并根據(jù)實(shí)際應(yīng)用構(gòu)建不同強(qiáng)度、不同調(diào)控機(jī)制的群體感應(yīng)系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)多樣的功能與應(yīng)用。2.1群體感應(yīng)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)群體感應(yīng)的實(shí)質(zhì)是某種持續(xù)性分泌的自體誘導(dǎo)物積累達(dá)到閾值后啟動(dòng)細(xì)菌特定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。群體感應(yīng)現(xiàn)象一般需要滿足兩個(gè)要素：一是自體誘導(dǎo)物的濃度與細(xì)菌種群密度成正相關(guān)；二是一定濃度的自體誘導(dǎo)物達(dá)到某一閾值后激活細(xì)菌的某些特殊基因并實(shí)現(xiàn)群體行為改變?；诖耍后w感應(yīng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)也分為兩步：一是篩選合適的小分子作為自體誘導(dǎo)物；二是通過(guò)工程改造使該信號(hào)分子調(diào)控胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。例如，Liu等[24]設(shè)計(jì)了一種類群體感應(yīng)系統(tǒng)，工程改造的大腸桿菌能夠以自然代謝產(chǎn)物HS作為自體誘導(dǎo)物，實(shí)現(xiàn)種2內(nèi)群體交流。在該工作中，HS作為大腸桿菌的天然代謝產(chǎn)物，濃度與種群數(shù)2量成正比關(guān)系；同時(shí)，重組醌氧化還原酶被引入細(xì)菌，可催化HS形成與CstR2轉(zhuǎn)錄阻遏因子相互作用HSnH分子，進(jìn)而啟動(dòng)下游CstR調(diào)控的基因環(huán)路。而在真核生物中，群體感應(yīng)元件的設(shè)計(jì)原則依然適用。Chen等[25]利用酵母表達(dá)來(lái)源于擬南芥的一種植物激素細(xì)胞分裂素(IP)作為自體誘導(dǎo)物，使其激活酵母內(nèi)源的磷酸化信號(hào)通路，調(diào)控胞內(nèi)基因表達(dá)，從而構(gòu)建出第一套真核生物的群體感應(yīng)體系；此外，還有團(tuán)隊(duì)以酵母交配使用的信息素作為自體誘導(dǎo)物，設(shè)計(jì)出受此信息素調(diào)控的基因回路，調(diào)控基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了酵母細(xì)胞中群體感應(yīng)元件的構(gòu)造[26]。這些研究表明，可以利用不同物種的基因元件，對(duì)原有代謝通路進(jìn)行改造修飾，如圖2所示，最終實(shí)現(xiàn)與天然群體感應(yīng)一樣的功能，而群體感應(yīng)元件庫(kù)的豐富將為相應(yīng)的科學(xué)應(yīng)用提供廣闊的技術(shù)平臺(tái)。圖圖2群體感應(yīng)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化Fig.2Developmentandoptimizationofquorumsensingsystems2.2群體感應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)化既有的群體感應(yīng)系統(tǒng)可能無(wú)法滿足不同實(shí)驗(yàn)中的需求，故而需要對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。如圖2所示，群體感應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)化可從蛋白和基因兩個(gè)角度。一方面，蛋白水平的優(yōu)化主要通過(guò)定向進(jìn)化或者計(jì)算模擬設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)。以一種應(yīng)用較為廣泛的群體感應(yīng)元件esaI-esaR為例，EsaR能夠針對(duì)不同啟動(dòng)子同時(shí)起到激活和抑制基因表達(dá)的效果[27-28]。然而該元件對(duì)于自體誘導(dǎo)物的敏感性非常低，根據(jù)定向進(jìn)化設(shè)計(jì)原理，研究者首先通過(guò)易錯(cuò)PCR建立目的蛋白的隨機(jī)突變庫(kù)，再設(shè)置特定條件進(jìn)行篩選，重復(fù)多次后，成功提高了EsaR對(duì)于自體誘導(dǎo)物的靈敏度，且篩選、表征了一系列不同響應(yīng)水平的EsaR群體感應(yīng)元件以滿足不同感應(yīng)強(qiáng)度場(chǎng)景的需要[29]。另一方面，基因水平的優(yōu)化方法多樣，可以通過(guò)改造啟動(dòng)子、改變?cè)截悢?shù)目、調(diào)節(jié)核糖體結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)弱等方式實(shí)現(xiàn)[30]。仍以esaI-esaR為例，esaRShong等[31]對(duì)EsaR結(jié)合的PesaR個(gè)EsaR結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了啟動(dòng)子對(duì)EsaR的靈敏度的調(diào)節(jié)，使得改造后的幾種啟動(dòng)子能夠?qū)ν粋€(gè)信號(hào)強(qiáng)度產(chǎn)生不同的表達(dá)強(qiáng)度。之后的研究在啟動(dòng)子后添加操縱子，如乳糖操縱子(lacO)，使其群體感應(yīng)強(qiáng)度能被更靈活地調(diào)控[32]。除了對(duì)群體感應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化與調(diào)控外，還可以通過(guò)基因水平的回路設(shè)計(jì)與改造，精確調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)的啟停。Williams等[26]將群體感應(yīng)中自體誘導(dǎo)物的啟動(dòng)子替換為外源分子調(diào)控的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，通過(guò)外加特定的誘導(dǎo)物開(kāi)啟群體感應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)群體感應(yīng)單次開(kāi)啟的調(diào)控。Miano等[23]通過(guò)構(gòu)建基于誘導(dǎo)物的酶促反應(yīng)鏈，可以搭建調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)且能多次開(kāi)關(guān)的群體感應(yīng)(iQS)系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)中，自體誘導(dǎo)物是一種酶，能夠?qū)⑷藶樘砑拥恼T導(dǎo)物轉(zhuǎn)化成最終能夠激活群體感應(yīng)的小分子。因此在添加一定量的誘導(dǎo)物后可基于加入量來(lái)啟動(dòng)不同強(qiáng)度的群體感應(yīng)響應(yīng)，又由于酶促反應(yīng)對(duì)誘導(dǎo)物的不斷消耗，使得誘導(dǎo)在持續(xù)一定時(shí)間后停止，實(shí)現(xiàn)基因回路的多次可控啟停。以上一系列的研究提出了多種群體感應(yīng)系統(tǒng)模塊的構(gòu)建思路，為其在合成生物學(xué)中的廣泛使用奠定了基礎(chǔ)。而在利用這些模塊構(gòu)建復(fù)雜基因回路時(shí)，可以通過(guò)數(shù)學(xué)建模的方式對(duì)元件的效果做出一定預(yù)測(cè)。在這個(gè)過(guò)程中，如何提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性是一大難點(diǎn)[33]，需要各個(gè)元件全面詳細(xì)地表征數(shù)據(jù)，還需要對(duì)系統(tǒng)內(nèi)部噪聲和異質(zhì)性進(jìn)行處理[19]。值得注意的是，盡管單個(gè)元件的功能已經(jīng)被研究和表征得十分詳盡，當(dāng)多個(gè)元件組合在一起的時(shí)候，其功能會(huì)產(chǎn)生一些意料之外的影響，而這些影響往往與細(xì)胞內(nèi)的熱力學(xué)因素和進(jìn)化因素有關(guān)[34]。這種影響一方面可能為基因回路的構(gòu)建帶來(lái)困擾，但另一方面也可能創(chuàng)造出更多的應(yīng)用可能性。3群體感應(yīng)基因元件的工程應(yīng)用群體感應(yīng)基因元件作為細(xì)菌間的一種信息交流工具，能夠很好地調(diào)控細(xì)菌的群體行為。針對(duì)其信息交流的特點(diǎn)，Tabor等以及Tamsir等[33，35]利用群體感應(yīng)中涉及的信號(hào)分子構(gòu)建了多細(xì)胞邏輯門，使得信號(hào)能在不同細(xì)胞間傳遞，完成較為復(fù)雜的邏輯運(yùn)算。此外更多的研究?jī)A向于利用其調(diào)控群體行為的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)治療、生物檢測(cè)等方面。3.1種群內(nèi)群體感應(yīng)行為調(diào)控3.1.1動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控群體感應(yīng)能夠使細(xì)胞在達(dá)到一定種群數(shù)量后改變?nèi)后w的基因表達(dá)，這個(gè)特點(diǎn)與發(fā)酵工程對(duì)動(dòng)態(tài)代謝產(chǎn)物調(diào)控的需求相契合。在傳統(tǒng)發(fā)酵工程領(lǐng)域，工程師通常會(huì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)部的代謝途徑進(jìn)行一系列的刪改，目的是最大化目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)效率。然而，在這一過(guò)程中，改造的代謝途徑可能會(huì)對(duì)細(xì)菌自身生長(zhǎng)產(chǎn)生代謝壓力甚至是細(xì)胞毒性[36-38]，因此需要合理的代謝優(yōu)化以保證細(xì)胞在“生長(zhǎng)”與“生產(chǎn)”兩相之間進(jìn)行適時(shí)的轉(zhuǎn)變。在實(shí)際操作中，通常采用在特定時(shí)間點(diǎn)添加誘導(dǎo)劑的方式，確保細(xì)菌種群達(dá)到一定數(shù)量后產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，保證產(chǎn)量。但是，使用誘導(dǎo)劑存在一些缺陷，比如誘導(dǎo)劑成本較高[39]，并不適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)使用[24]；化學(xué)誘導(dǎo)劑有不可逆性，一經(jīng)添加便會(huì)一直存在于介質(zhì)中，只能起到單次控制的效果[40]；此外，因?yàn)樾枰獙?shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并在合適的時(shí)機(jī)添加誘導(dǎo)劑，導(dǎo)致步驟較為煩瑣等。這些缺陷給傳統(tǒng)合成生物學(xué)的工業(yè)化造成了較大的障礙。在此基礎(chǔ)上，Gupta等[41]構(gòu)建了動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，但這種方法需要針對(duì)所構(gòu)建的不同代謝過(guò)程分別尋找受相應(yīng)代謝小分子調(diào)控的啟動(dòng)子，而找到的啟動(dòng)子卻又常常不具備合適的表達(dá)強(qiáng)度，加大了工作量與難度。針對(duì)這種情況，有學(xué)者開(kāi)始使用群體感應(yīng)元件構(gòu)建動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，即通過(guò)群體感應(yīng)改變細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，從而保證生長(zhǎng)與生產(chǎn)兩種模式的轉(zhuǎn)變。Kim等[42]指出，與化學(xué)誘導(dǎo)的系統(tǒng)相比，群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的系統(tǒng)能夠更好地讓體系中的細(xì)胞做出統(tǒng)一的反應(yīng)與改變。通過(guò)群體感應(yīng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)的兩相發(fā)酵，即讓細(xì)菌生長(zhǎng)到一定程度自動(dòng)進(jìn)入生產(chǎn)模式，其木糖酸的產(chǎn)量能與化學(xué)誘導(dǎo)法達(dá)到同一水平[24]；通過(guò)luxI-luxR群體感應(yīng)系統(tǒng)構(gòu)建的生產(chǎn)甜沒(méi)藥烯(bisabolene)的動(dòng)態(tài)代謝調(diào)節(jié)，使產(chǎn)量比之前的誘導(dǎo)體系增加了44%[43]。而相比luxI-luxR等系統(tǒng)而言，esaI-esaR系統(tǒng)能夠針對(duì)不同啟動(dòng)子同時(shí)起到激活或抑制基因表達(dá)的作用，更好地實(shí)現(xiàn)代謝重分流的效果[44-45]。在單一群體感應(yīng)系統(tǒng)的直接應(yīng)用之外，Jiang等[46]在一個(gè)細(xì)胞中嘗試構(gòu)建了las和tra兩個(gè)完全正交的群體感應(yīng)系統(tǒng)，使其中一個(gè)系統(tǒng)位于另一個(gè)系統(tǒng)的下游。通過(guò)這種設(shè)計(jì)，兩個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)控制的不同基因能夠按照一定時(shí)間順序依次表達(dá)。這項(xiàng)研究對(duì)于一些更為復(fù)雜的代謝分流過(guò)程有著很大的應(yīng)用價(jià)值。表1比較了化學(xué)誘導(dǎo)與群體感應(yīng)在代謝調(diào)控中的應(yīng)用。表1化學(xué)誘導(dǎo)與群體感應(yīng)在代謝調(diào)控中應(yīng)用的對(duì)比[23-24,26,39-40]Miano誘導(dǎo)物的酶促反應(yīng)鏈，搭建調(diào)控嚴(yán)Tab.1Comparisonbetweenchemicalinducersandquorumsensingontheirapplicationinmetabolicregulation[23-24,26,39-40]項(xiàng)目化學(xué)誘導(dǎo)劑通過(guò)加入化群體感應(yīng)的基因表達(dá)開(kāi)啟與否本來(lái)由元件內(nèi)源參數(shù)決定，除精確件、調(diào)整內(nèi)源參數(shù)，還可以將群體感應(yīng)中制基因表達(dá)的時(shí)間物實(shí)現(xiàn)對(duì)群體感應(yīng)行為的控制[26]合適的量實(shí)時(shí)決定群體行為較差中，只能起較差，但可以優(yōu)化謹(jǐn)且能多次開(kāi)關(guān)的群體感應(yīng)系統(tǒng)(iQS)項(xiàng)目化學(xué)誘導(dǎo)劑化學(xué)誘導(dǎo)劑業(yè)生產(chǎn)使用[24]只在最初基因回路構(gòu)建上存在一次性成本同時(shí)，由于生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程需求的復(fù)雜性，群體感應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)體系可以與其他調(diào)控體系結(jié)合，構(gòu)成邏輯門，從而對(duì)生產(chǎn)過(guò)程取得更精準(zhǔn)的調(diào)控。比如，細(xì)胞所處在的生長(zhǎng)狀態(tài)如對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期等也會(huì)對(duì)細(xì)胞的生產(chǎn)效率產(chǎn)生很大的影響[47]，而細(xì)胞生長(zhǎng)狀況與細(xì)胞種群數(shù)量并沒(méi)有絕對(duì)的關(guān)聯(lián)?；诖?，He等[48]將群體感應(yīng)與壓力感受系統(tǒng)結(jié)合，形成邏輯“與”門(AND)。群體感應(yīng)系統(tǒng)用來(lái)保證細(xì)胞的種群密度，壓力感受系統(tǒng)能夠很好地反映細(xì)胞所處的生長(zhǎng)狀態(tài)，這兩者保證細(xì)胞的種群密度達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)處于平臺(tái)期時(shí)，自動(dòng)進(jìn)入生產(chǎn)狀態(tài)。單純的群體感應(yīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)代謝調(diào)節(jié)雖然能很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)“動(dòng)態(tài)”的需求，但在手動(dòng)可控性上仍然有欠缺[36]。Williams等[26]成功將自動(dòng)調(diào)控和手動(dòng)調(diào)控緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)可控的自動(dòng)調(diào)控體系。該簡(jiǎn)單組合方法使用了一種能夠響應(yīng)介質(zhì)中芳香族氨基酸的ARO9啟動(dòng)子表達(dá)自體誘導(dǎo)物，使得群體感應(yīng)功能能夠根據(jù)芳香族氨基酸的種類和濃度發(fā)生改變。這項(xiàng)研究雖然是在真核酵母中進(jìn)行的，但可以在原核生物設(shè)計(jì)中借鑒思路。此類額外的設(shè)計(jì)可能會(huì)導(dǎo)致工業(yè)成本相對(duì)增加，但優(yōu)點(diǎn)是不需要通過(guò)煩瑣的元件改造，就能直接對(duì)群體感應(yīng)強(qiáng)度起到調(diào)控作用，從而使群體感應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控體系在工業(yè)生產(chǎn)中取得更靈活的應(yīng)3.1.2群體周期性行為控制群體感應(yīng)的另一大特點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞群體的同步作用，這使得群體感應(yīng)可以與單個(gè)細(xì)胞中作用的回路結(jié)合，將回路所控制的單個(gè)細(xì)胞的行為擴(kuò)展到整個(gè)群體當(dāng)中，產(chǎn)生相應(yīng)的群體行為。其中，最為突出的是群體感應(yīng)對(duì)群體同步周期性行為的實(shí)現(xiàn)。相比穩(wěn)定不變的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，周期性振蕩系統(tǒng)蘊(yùn)含著更多的信息，因此可以在信息的接受、傳遞上發(fā)揮更多的功能。同時(shí)，相比于通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度傳遞信息，通過(guò)振蕩頻率傳遞的信息也更為穩(wěn)定可靠。例如，通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度如熒光強(qiáng)度傳遞信息，不同測(cè)量?jī)x器會(huì)給出不同測(cè)量結(jié)果，為使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，需要對(duì)不同儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，非常煩瑣；但若測(cè)量振蕩頻率則不會(huì)出現(xiàn)類似的問(wèn)題[30]。另外，周期性的行為還能保證系統(tǒng)不過(guò)載，適應(yīng)多種需求。為了讓細(xì)胞呈現(xiàn)出周期性行為，原則上會(huì)設(shè)計(jì)負(fù)反饋回路[49-50]，達(dá)到一盛一衰的振蕩效果。而現(xiàn)已有多種回路可以實(shí)現(xiàn)振蕩行為，如三元抑制回路，通過(guò)三個(gè)小分子循環(huán)式相互抑制，在原理上形成一個(gè)負(fù)反饋回路[51]；二元振蕩回路，讓激活劑在促進(jìn)自身抑制劑表達(dá)形成負(fù)反饋的同時(shí)，促進(jìn)自身進(jìn)一步表達(dá)，實(shí)現(xiàn)正反饋與負(fù)反饋的耦合，促促進(jìn)振蕩的信號(hào)進(jìn)一步加強(qiáng)，使振蕩回路不易受外界噪聲干擾[52-54]；還有五元抑制回路等[55]。圖3列出了這些基因回路。圖3三種典型的基因回路用于調(diào)節(jié)細(xì)胞振蕩行為Fig.3Threetypicalgenecircuitsusedforregulatingintracellularoscillationbehaviors但是，以上振蕩基因回路只能在單個(gè)細(xì)胞中發(fā)揮功能，當(dāng)上升到群體層面時(shí)，不可避免地會(huì)因?yàn)椴煌?xì)胞之間的異質(zhì)性，逐漸趨于混亂[51]；而在現(xiàn)實(shí)生活中，細(xì)菌通常是成群出現(xiàn)的。這使得單個(gè)細(xì)胞周期性行為的應(yīng)用受到很大的限制。在振蕩回路的基礎(chǔ)上引入群體感應(yīng)元件，可以使振蕩行為在整個(gè)細(xì)胞群體呈現(xiàn)出一致的周期性。如圖4所示，這些嘗試總體上分為三種思路。圖4三種典型思路用于構(gòu)建多細(xì)胞振蕩體系[30,56-57][(a),(b),(c)分別對(duì)應(yīng)三種振蕩回路與群體感應(yīng)結(jié)合的思路；(d)利用群體感應(yīng)形成規(guī)律圖案[基于思路二構(gòu)建的系統(tǒng)，通過(guò)群體感應(yīng)，自體誘導(dǎo)物AHL的濃度周期性到達(dá)閾值，而菌落邊緣的細(xì)菌有更強(qiáng)的基因表達(dá)能力(表達(dá)熒光蛋白)，兩者構(gòu)成AND邏輯門，使菌落呈現(xiàn)出規(guī)律的圖案]；(e)實(shí)現(xiàn)更大范圍群體周期性行為的同步；(f)利用群體感應(yīng)實(shí)現(xiàn)的震蕩系統(tǒng)治療癌癥]Fig.4Threestrategiesforconstruclingmulticellularoscillationsystems[30,56-57][(a),(b)and(c)referstoeachofthethreestrategiesforcombiningoscillationcircuitwithquorumsensing.(d)FormingregularpatternusingQS.ByusingmethodB,autoinducerconcentrationconcentrationperiodicallyreachesthethreshold.Sinceonlybacteriaattheedgeofthecolonyhavehighergeneexpression(liketheexpressionoffluorescentprotein),anANDlogicgateisconstructedtomakethecolonyshowrhythmicpattern.(e)Realizationofthecollectiveoscillationinabiggerrange.(f)EmploymentofQSoscillationsystemincancertreatment]思路一將二元振蕩回路與一個(gè)群體感應(yīng)元件直接結(jié)合，使得振蕩回路中的激活劑在激活自身和抑制劑表達(dá)的同時(shí)，激活群體感應(yīng)分子的表達(dá)，而群體感應(yīng)分子會(huì)進(jìn)一步激活激活劑自身的表達(dá)。從原理上講，該方法是在原有正負(fù)反饋聯(lián)合的基礎(chǔ)上，增加了一個(gè)正反饋。Mcmillen等[19]通過(guò)數(shù)學(xué)建模，證明其的確能夠起到群體內(nèi)的共同振蕩效果[圖4(a)]。不過(guò)，僅僅靠建模證明其有效性還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，其具體表現(xiàn)還需要通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。思路二直接利用群體感應(yīng)元件設(shè)計(jì)二元振蕩回路，用自體誘導(dǎo)物作為激活劑，使其在達(dá)到閾值后同時(shí)促進(jìn)自身分子和其抑制劑的產(chǎn)生。根據(jù)這個(gè)思路，有學(xué)者使用luxI-luxR的群體感應(yīng)系統(tǒng)，以luxI基因產(chǎn)生的自體誘導(dǎo)物AHL作為激活劑，以能夠催化AHL降解的AiiA作為抑制劑，構(gòu)建出能夠周期性產(chǎn)生熒光的細(xì)菌群體[圖4(b)，圖4(d)]，研究同時(shí)指出，通過(guò)調(diào)整群體感應(yīng)元件的強(qiáng)度，能夠產(chǎn)生不同的振蕩頻率[20-21]。這也很好地驗(yàn)證了群體振蕩傳遞信息的可行性，如用作新型生物感受器。盡管該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)群體行為同步化，這個(gè)群體仍被限制在很小的空間范圍內(nèi)。超過(guò)一定的空間距離，群體感應(yīng)分子無(wú)法及時(shí)到達(dá)，會(huì)造成信號(hào)延遲甚至同步失敗。為解決此問(wèn)題，Prindle等[30]將信號(hào)強(qiáng)卻僅適用短程傳輸?shù)娜后w感應(yīng)系統(tǒng)與信號(hào)弱卻適用遠(yuǎn)程傳輸?shù)难趸€原信號(hào)系統(tǒng)結(jié)合，利用過(guò)氧化氫氣體快速的傳播能力，實(shí)現(xiàn)了更大范圍群體的同步周期性行為[圖4(b)，圖4(e)]，并提高了周期的時(shí)間精度?；谛碌南到y(tǒng)，該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種砷元素感受器，能夠較為精準(zhǔn)地反映環(huán)境中砷的濃度，并由上百個(gè)小菌落組成的陣列通過(guò)不同的振蕩頻率表現(xiàn)出來(lái)。思路三以思路二為基礎(chǔ)，使用裂解自殺基因代替抑制劑，最終實(shí)現(xiàn)種群數(shù)量的周期性變化。這種回路被稱為SLC(synchronizedlysiscircuit)回路[21]，其特點(diǎn)是當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到閾值后，激活裂解自殺基因的表達(dá)，細(xì)胞數(shù)量迅速減少，此后少量殘留的細(xì)胞重新增殖，進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。這個(gè)回路能夠很好地防止細(xì)胞過(guò)度增長(zhǎng)，并且能夠周期性地釋放細(xì)胞中的內(nèi)含物[圖4(c)，4(f)]。近幾年，活菌治療的概念在不斷普及，而這種治療方法有兩個(gè)重點(diǎn)：一是需要能通過(guò)釋放藥物等方式起到治療效果；二是盡可能減少細(xì)菌在人體中可能造成的副作用[58]，包括防止細(xì)菌過(guò)度增殖造成體內(nèi)感染[59]等。通過(guò)在細(xì)菌中結(jié)合SLC回路和小分子藥物如溶血素、CD47的納米拮抗劑、CCL21等的合成，科學(xué)家們?cè)谛∈篌w內(nèi)實(shí)現(xiàn)了周期性給藥，并很好地抑制了腫瘤[21，57]。3.2種群間群體感應(yīng)行為調(diào)控在自然界中，細(xì)菌并不以單一種群獨(dú)立存在。不論是在大氣、海洋、土壤中，還是在生物體內(nèi)，微生物都以多個(gè)物種共生的方式生存在一起，彼此之間形成復(fù)雜的種群關(guān)系。為了更好地利用微生物，不僅需要調(diào)控同種菌種之間的行為，更要對(duì)不同微生物菌群之間的關(guān)系進(jìn)行有效的控制，從而在共生菌群之間實(shí)現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)和基因調(diào)控等方面的分工合作[60]，最終實(shí)現(xiàn)合成生物學(xué)在人體健康、環(huán)境、能源、農(nóng)業(yè)等方面更廣泛的應(yīng)用[61]。在這一方面，種群之間存在的群體感應(yīng)元件被認(rèn)為是構(gòu)造異種菌體系最有前景的基因元件之一[62]。為了實(shí)現(xiàn)菌群間復(fù)雜的信號(hào)交流，通常需要結(jié)合多套群體感應(yīng)體系，構(gòu)建邏輯基因回路，使異種菌間產(chǎn)生穩(wěn)定的種群關(guān)系。比如，Chen等[63]報(bào)告通過(guò)整合兩套群體感應(yīng)體系，構(gòu)建了由激活型菌與抑制型菌組成的混合細(xì)菌群，使兩個(gè)不同基因組成的細(xì)菌群體在基因表達(dá)上產(chǎn)生相互依賴的同步振蕩[圖5(a)]。微生物復(fù)雜種間關(guān)系的構(gòu)建案例[63,68-70]Fig.5Casesoftheconstructionofcomplexbacterialinterspecificrelationship[63,68-70]由于每種菌中都使用了多套群體感應(yīng)系統(tǒng)，不同群體感應(yīng)系統(tǒng)之間的正交性非常值得關(guān)注。不同的群體感應(yīng)系統(tǒng)在體系中可能發(fā)揮了不同的促進(jìn)或抑制作用，如果不同系統(tǒng)的群體感應(yīng)分子產(chǎn)生交互的影響，很有可能導(dǎo)致系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)性崩潰。只有保持足夠的正交性，才能保證種群關(guān)系的穩(wěn)定性，防止某一菌群脫離系統(tǒng)[64]。為了獲得更多有足夠正交性的細(xì)菌間信號(hào)交流系統(tǒng)，Du等[65]從頭設(shè)計(jì)了十種類似群體感應(yīng)的信號(hào)交流系統(tǒng)，規(guī)避了天然群體感應(yīng)由于信號(hào)分子結(jié)構(gòu)類似而產(chǎn)生的相互干擾。但也有學(xué)者認(rèn)為，不完全正交性可以為所構(gòu)建系統(tǒng)的復(fù)雜性提供更多可能[66]。在構(gòu)建由異種菌組成的系統(tǒng)時(shí)，一個(gè)不可避免的問(wèn)題是如何防止體系中任意一種菌的過(guò)度生長(zhǎng)，從而保證每一種菌都能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于系統(tǒng)中[67]。有學(xué)者通過(guò)模擬自然生態(tài)系統(tǒng)中的物種間關(guān)系，構(gòu)建不同菌之間的生長(zhǎng)關(guān)系。最經(jīng)典的是早期對(duì)捕食與競(jìng)爭(zhēng)的種間關(guān)系的模擬，研究者很好地抓住了這種關(guān)系的特點(diǎn)，即“捕食菌”促進(jìn)“被捕食菌”死亡，而“被捕食菌”抑制“捕食菌”的死亡，利用群體感應(yīng)構(gòu)建了相應(yīng)體系，從而使兩個(gè)菌群在數(shù)量上呈現(xiàn)此起彼伏的關(guān)系，使得兩種菌能夠長(zhǎng)期在系統(tǒng)中共存[圖5(b)][68]。這種利用生態(tài)學(xué)種間關(guān)系的設(shè)計(jì)原理為之后的研究提供了很好的思路。例如，2018年，Kong等[69]利用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的群體感應(yīng)分子和抑菌分子，即乳酸鏈球菌肽(nisin)和乳球菌素A(LcnA)的合成通路，對(duì)已有信號(hào)通路重新設(shè)計(jì)，在兩種菌之間成功構(gòu)建出多種種間關(guān)系，開(kāi)發(fā)出可長(zhǎng)期存在的異種微生物群體[圖5(c)]。該文章還通過(guò)數(shù)學(xué)建模的方式證明有希望通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控三種菌之間的相互促進(jìn)或抑制關(guān)系，從而維持三種菌的數(shù)量分布。與上述思路不同，Scott等[66]嘗試分別在每種菌中獨(dú)立使用了SLC回路，異種菌彼此有獨(dú)立的群體感應(yīng)系統(tǒng)，幾乎完全正交，互不干擾。通過(guò)調(diào)整異種菌各自的SLC回路參數(shù)，最終實(shí)現(xiàn)兩種菌的共培養(yǎng)。盡管建模數(shù)據(jù)顯示可以實(shí)現(xiàn)不同模式的種群數(shù)量振蕩，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)卻沒(méi)有很好地展示，可見(jiàn)完全獨(dú)立無(wú)交流的異種菌系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)中完全實(shí)現(xiàn)仍是一大挑戰(zhàn)，但如果后續(xù)研究能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)上述所謂的完全正交體系，則能大大簡(jiǎn)化異種菌系統(tǒng)構(gòu)建工作。在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)的異種菌間關(guān)系調(diào)控能否在真實(shí)環(huán)境中發(fā)揮預(yù)估的功能決定了菌群的實(shí)際應(yīng)用效果。最近Kim等[70]成功在哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)引入群體感應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏桿菌和大腸桿菌的信息交流，證明了調(diào)控哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)異種菌交流的可能性[圖5(d)]。隨著調(diào)控越來(lái)越復(fù)雜，需要控制的細(xì)菌范圍也相應(yīng)擴(kuò)大，然而，像上一部分所提到的結(jié)合氣體分子構(gòu)造的群體感應(yīng)體系[30]，在復(fù)雜真實(shí)的環(huán)境中并不適用。為了解決這一問(wèn)題，有學(xué)者將研究重點(diǎn)放在了群體感應(yīng)內(nèi)在的信號(hào)反饋結(jié)構(gòu)上，并證明利用合適的