04-實(shí)驗(yàn)四-DNA限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)四DNA限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳

EcoRIRestrictionEnzyme識(shí)別序列------G↓AATTC------------CTTAA↓G------實(shí)驗(yàn)原理---限制性內(nèi)切酶及酶切反應(yīng)BamHIRestrictionEnzyme識(shí)別序列：------G↓GATCC------------CCTAG↓G------HindIIIRestrictionEnzyme識(shí)別序列：------A↓AGCTT------------TTCGA↓A------每一種限制性內(nèi)切酶都有特定的反應(yīng)條件：

pH范圍：7.5~8.0緩沖液組份:Tris(三羥甲基氨基甲烷）、NaCl、MgCl2、

溫育溫度：37℃反應(yīng)體系：

DNA(1ug或更少)5ul10xBuffer2ul

RestrictionEnzyme3ulH2O

10ulTotal20ul混勻，37度保溫30分鐘實(shí)驗(yàn)原理---瓊脂糖凝膠電泳電泳是在一個(gè)電場(chǎng)的作用下，在瓊脂糖支持介質(zhì)上，能將一個(gè)混合物分離成若干條區(qū)帶（若干個(gè)組分）的過(guò)程。瓊脂糖凝膠電泳是一種簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。將瓊脂糖粉末加熱到熔點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成良好的電泳介質(zhì)。瓊脂糖瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.80.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2電泳法的優(yōu)點(diǎn)凡是能帶電的物質(zhì)，都可以用電泳法分離。樣品用量少。設(shè)備簡(jiǎn)單?？稍谑覝剡M(jìn)行。操作簡(jiǎn)便，費(fèi)時(shí)不多不同類型的電泳，有不同的用途。改進(jìn)或找到更好的支持介質(zhì)，就有可能大大地提高分辯率。1、TAE電泳緩沖液Tris-base冰醋酸EDTA2、瓊脂糖凝膠（0.8%）瓊脂糖：0.8gTAE：100ml

試劑3、溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)EB染色液工作液濃度：0.01~0.03mg/mlEB是一種熒光染料，其扁平分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。4、6xLoadingDye組成0.25%bromophenolblue（深藍(lán)色）0.4%orangeG（黃色）10mol/LTirs-HCl(pH7.5),50mol/LEDTA使用量

5份DNA樣品溶液加1份Blue/6xLoadingDye操作步驟一、酶切反應(yīng)反應(yīng)體系：

λ－DNA5ul10xBuffer2ul

HindIII3ulH2O10ulTotal20ul混勻，37度保溫30分鐘二、電泳。1、電泳前的準(zhǔn)備工作輕輕刷干凈電泳制膠的梳子，模板，電泳槽，用蒸餾水洗凈晾干，把制膠槽放入模板中。2、制膠

(1)每組稱取瓊脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入

30ml電泳緩沖液，微波爐加熱直到瓊脂糖溶化。

（2)每組將瓊脂糖液冷卻到約70℃,輕輕倒入膠槽，并插

上梳子。凝固約30min.

(3)取出梳子，把膠放在電泳槽中，準(zhǔn)備電泳。

3、點(diǎn)樣和電泳987654321987654321(1)將酶切產(chǎn)物、自制DNA與6xLoadingDye混合，每個(gè)樣品混合后體積均為24ul。a.自制DNA20ul+4ulLoadingDyeb.酶切產(chǎn)物20ul+4ulLoadingDye(2)將標(biāo)準(zhǔn)λDNA/HandIII、λDNA、酶切產(chǎn)物、自制DNA各10ul點(diǎn)入點(diǎn)樣孔。(3)電泳。(4)EB染色10min。（注意不要污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境）λ-DNA/HindIIIMarkers

片段大?。╞p）和電泳帶型示意圖點(diǎn)