同位素標記技術(shù)在分子生物學實驗技術(shù)中的應用課件

同位素標記技術(shù)在分子生物學實驗技術(shù)中的應用幻燈片本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！標記探針探針〔proble)帶有檢測標記的，與被檢測目標物分子具有特異性互補反響性能的探測物分子或分子片斷。探針類別核酸探針DNA、RNA探針非核酸探針，抗體、蛋白質(zhì)分子標簽等

核酸探針核酸探針DNA探針雙鏈DNA探針

單鏈DNA探針

DNA探針

cDNA探針

RNA探針

標記類別標記信號放射性標記32P，33P，3H,35S，125I，131I非放射性標記生物素、酶、地高辛配體、熒光素等。標記位置均勻標記非均勻標記如DNA末端標記標記核素核素半衰期衰變方式粒子能量/MeV粒子能量/MeV3H32P33P35S125I131I12.33a14.26d25.5d87.23d60d8.04的-(100)-(100)-(100)-(100)EC-(100)0.01861.7090.2480.1670.6050.3330.027-0.032標記單體摻入DNA探針的常用單體標記化合物[-32p]dATP，[-32p]dCTP，[-32p]UTP，[-32p]ATP。國內(nèi)供給商：北京福瑞國外供給商：UK標記單體在分子克隆操作中用于標記核酸分子的標記物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S。在摻入核苷酸的標記過程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用α位磷酸被標記的三磷酸核苷酸，如[α-32P]dATP。而在標記5'末端磷酸基團的反響中一般使用γ位磷酸被標記的ATP。放射性的信號通過X-光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。

核酸探針標記法1.雙鏈DNA探針⑴切口平移法首先用DNAaseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后借助于E.coliDNA聚合酶I的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時利用該酶5`→3`聚合酶活性，使同位素標記的互補核苷酸補入缺口。這兩種活性同時作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記DNA探針。最適宜的切口平移片段一般為50-500個核苷酸,產(chǎn)生均勻標記的探針。切口平移反響受幾種因素的影響:(a)產(chǎn)物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性,故應使用仔細純化后的DNA。

切口平移法

(2)隨機引物法

通過熱變性使模板DNA變?yōu)閱捂淒NA，隨機引物與單鏈DNA退火后，利用KlenowFragment合成互補鏈。此時如果底物中dNTP的一種或幾種被[α-32P],[α-35S],[3H]等標記時，那么合成的互補鏈DNA也被標記。合成后的雙鏈DNA通過熱變性變成單鏈后即可用作雜交探針。隨機引物法DNA標記法比較：切口平移法

隨機引物法反應時間延長反應時間會降低標記效率。必須確保反應時間。短時間內(nèi)即可得到高比活性的探針。即使反應時間延長也不受影響。探針比活性～108dpm/μg

～109dpm/μg模板純度

瓊脂糖等抑制反應。即使有瓊脂糖等混入，也相對不受影響。反應后純化

需要除去未反應的dNTP

不需要除去未反應的dNTP模板量要求≥1μg≥25ng

2.單鏈DNA探針⑴從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針M13噬菌體是一種單鏈DNA噬菌體，但它在感染宿主〔大腸桿菌〕后，在菌體細胞內(nèi)復制成為雙鏈并繁殖，又以單鏈形式透出菌體，再度感染新的宿主菌。將模板序列克隆到M13噬菌體,以特定的同用引物或人工合成寡合苷酸為引物，在[-32P]dNTP存在下，由Klenow片斷酶促合成標記探針，反響完畢后，酶切長短不一的產(chǎn)物，然后通過變性凝膠電泳與模板別離。⑵從RNA合成單鏈cDNA探針用RNA為模板合成cDNA探針所用的引物有兩種:a.寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA3‘末端序列。b.可用隨機引物合成cDNA探針。該法可防止上述缺點,產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復雜得多,應預先盡量富集mRNA中的目的序列。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經(jīng)SephadexG-50柱層析即可得到單鏈探針。3.寡核苷酸探針假設(shè)只知道待別離的目的基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而對其核苷酸序列一無所知，即可設(shè)計合成寡核苷酸探針。利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。單一序列的寡核苷酸探針.種類許多兼并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫.4.RNA探針許多載體如pBluescript,pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反響體系中假設(shè)參加經(jīng)標記的dNTP，那么可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點,又具有許多DNA單鏈探針所沒有的優(yōu)點，主要是：RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反響中RNA探針比一樣比活性的DNA探針所產(chǎn)生信號要強。RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進展RNA構(gòu)造分析比用DNA探針效果。5.末端標記〔1〕一種是在5`末端加成標記法：先用堿性磷酸酶〔AP〕去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標記的ATP轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上?！?〕在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個單標記的ddUTP。6.PCR擴增標記

在PCR擴增時參加標記的dNTP，不僅能對探針DNA進展標記還可進展大量擴增，尤其適合于探針DNA濃度很低的情形。標記一般流程核酸分子雜交互補的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針序列進展特異性的靶序列檢測。

雜交類型核酸雜交固相雜交印跡雜交SouthernNorthern斑點(dot)狹槽(slot)原位雜交菌落噬菌真核液相雜交Southern雜交

DNA片段經(jīng)電泳別離后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括以下步驟:

(1)酶切DNA,凝膠電泳別離各酶切片段,然后使DNA原位變性。

(2)將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。

(3)預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。

(4)讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。

(5)通過顯影檢查目的DNA所在的位置。

檢測靈敏Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32P標記的高比活性探針的(>109cpm/μg)互補DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,那么可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。

帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程電泳示意圖凝膠電泳轉(zhuǎn)印方法

(1)毛細管虹吸優(yōu)點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉(zhuǎn)移時間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。

(2)電泳轉(zhuǎn)印將DNA變性后,經(jīng)電泳印移至帶電荷的尼龍膜上。優(yōu)點是可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段，缺點是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當毛細管和真空轉(zhuǎn)移無效時,才予以采用。

(3)真空轉(zhuǎn)移一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號比Southern轉(zhuǎn)移強2-3倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂,在洗膜不嚴格時,其背景比毛細管法的要高。虹吸印跡分子雜交爐雜交過程成像觀測放射性自顯影利用標記核素自身的放射性射線使感光材料感光成象的過程。目前常用的方法有:

傳統(tǒng)的膠片自顯影感光屏：醫(yī)用X光片；原理：爆光過程，射線粒子使X光片乳膠基質(zhì)中均勻分布的溴化銀晶粒感光形成物點的潛影，然后經(jīng)顯影及定影得像圖。膠片影象可在底片上直接觀察。X光自顯影暗盒及圖像增強屏成像觀測儲存磷光屏〔storagephosphorscreen〕一種由磷光晶體制成的影像屏〔ImagingPlate)。經(jīng)射線爆光后IP以潛能儲存射線能，當在讀取裝置下掃描讀取時，IP在掃描激光下釋放潛能發(fā)出藍綠光，光強與爆光時射線強度成正比，用光電傳感器轉(zhuǎn)換電信號，再經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換成二進制編碼信號，由計算機成象系統(tǒng)合成為影象圖。

操作：用塑料薄膜蓋電泳凝膠，貼附于裝于暗盒的磷光屏曝光，然后在成像儀上，通過掃描磷光屏上儲存的光能進展成象。UVI化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)與著名的MolecularDynamicsTMPhosphorImagerTM系統(tǒng)是一樣，臺風儲磷技術(shù)磷屏Typhoon9000系列能對所有電離輻射源提供高分辨率圖像并準確定量：

3H

32P

14C

33P

125I

35S

18F

99mTc大成像面積，高分辯光學系統(tǒng)和靈敏的磷屏組合，為您提供可靠的實驗結(jié)果。以下圖給出的是用32P標記的AtlasTM微陣列(macroarray)在GP屏上的圖像。成像觀測閃爍光纖屏由塑料光纖制成的板，光纖中填有鉛和發(fā)光染料，使射線能轉(zhuǎn)換為可見光光子，然后再由電荷耦合器件CCD攝像機成像。較膠片和磷光屏的分辨率好，近實時成像且需曝光量低。成像觀測放射性薄層掃描儀由空間位置靈敏探測器組成核探測儀器。可用于薄層層析板、凝膠電泳轉(zhuǎn)印膜上放射性條帶的直接定位測定。美國的Bioscan公司

AR-2000圖像掃描儀

AR2000圖像掃描儀可對所有類型同位素〔包括3H〕標記的TLC板、凝膠、印跡進展直接定位定量計數(shù)測量。掃描儀采用充氣式計數(shù)器，可檢測γ和β射線的同位素。對整塊薄層層析條帶的掃描可在1分鐘內(nèi)完成。整套系統(tǒng)包括一個儀器控制和數(shù)據(jù)采集軟件，掃描結(jié)果以層析圖或2D圖像顯示，自動完成對峰的定量，并以多種方式顯示結(jié)果。

·應用于TLC板、凝膠和印跡

·不需破壞TLC板即可進展定量

·對所有類型同位素〔包括3H〕靈敏

·簡單易用的WinScan軟件

·快速、自動、可靠的運行

·提供出色的空間分辨率

·針對1、2、3塊TLC板可選擇不同的型號

·2-D彩色圖像

·主要應用于放射化學純度、脂類生物化學、代謝研究、酶分析、毒理學研究等領(lǐng)域。

瑞士卡瑪產(chǎn)地：德國同位素薄層掃描儀技術(shù)參數(shù)掃描面積為400×200mm〔Gita,Rita〕50×200mm(miniGita,miniRita)

掃描速度：可選

軌道數(shù)目：1-80

檢測器：γ-radiation(BGOdetector)，?-radiation(GMcountingtube)，gasflow

檢測能量范圍：0-2000KeV

可檢測的放射物:γ-radiation(BGOscintillationprobe)

背景:129I:0.7cps(20-100KeV)

靈敏度:129I:20Bqin10min

分辨率:129I:2-3mm(dependingontheusedcollimator)

可檢測的放射物:?-radiationopenproportionalcountingtube(Recommendedfor3H-requirescountinggasP10=90%Ar10%Ch4)

背景:18F:0.1cps

靈敏度:18F:10Bqin10min

分辨率:18F:1-2mm

防護措施INSPECTORNorthern雜交Northern雜交與Southern雜交很相似,主要區(qū)別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進展,以去除RNA中的二級構(gòu)造,保證RNA完全按分子大小別離。變性劑主要有3種:乙二醛，甲醛，羥甲基汞。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移一樣的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。菌落原位雜交對分散在假設(shè)干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落〔100-200〕進展克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板外表的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進展原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。菌落原位雜交

斑點雜交斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列別離,不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。DNA序列分析

Sanger雙脫氧鏈終止法Cambridge的F.Sanger于1977年創(chuàng)造。根本原理：①DNA聚合酶能夠以單鏈DNA作為模板，準確合成的DNA互補鏈；②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反響。在DNA測序反響中，參加模板DNA，引物〔特異性引物，如T7，T3，M13等〕，DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。DNA序列分析Maxam-Gilbert化學修飾法(哈佛大學)對一個末端標記的DNA片段，用化學試劑在A、G、C、T處特定地裂解DNA片段。把反響分為四組，每一組反響特異性地針對某一種或某一類堿基，并且要保證每個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾，這樣，在每一組反響中都在同一個或兩個核苷酸處DNA鏈發(fā)生斷裂，由于堿基位置不同，就會產(chǎn)生一組不同長度的DNA片段。最后，經(jīng)過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳別離，放射自顯影后就可讀出待測DNA的核苷酸序列。化學修飾法Maxam-Gilbert法所用的化學修飾技術(shù)堿基特異修飾方法G在pH8.0下，用硫酸二甲酯對N7進行甲基化，使C8－C9鍵對堿裂解具有特異的敏感性A+G在pH2.0下，哌啶甲酸可以使嘌呤環(huán)的N原子質(zhì)子化，從而導致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在下，只有胞嘧啶可同肼發(fā)生明顯可見的反應A+C在90℃下，用1.2mol/LNaOH處理，可使A位點發(fā)生劇烈的斷裂反應，而C位點的斷裂反應較微弱DNA序列分析DNA序列分析自動化用四甲基假設(shè)丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導下發(fā)出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學終止法進展測序反響，跑DNA凝膠后用計算機檢測。熒光標記物ddGTPddATPddTTPddCTP單泳道電泳及信號收集正極負極計算機排序5ˊGSFLX系統(tǒng)超高通量測序技術(shù)原理GSFLX系統(tǒng)的測序原理和GS20一樣，也是一種依靠生物發(fā)光進展DNA序列分析的新技術(shù)：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來(圖1)。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以到達實時測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進展電泳；具有分析結(jié)果快速、準確、靈敏度高和自動化的特點。

GSFLX系統(tǒng)的操作過程GSFLX系統(tǒng)提供了完整的從樣品制備到后續(xù)的生物信息學分析解決方案。1〕樣品種類：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測定：包括基因組DNA，PCR產(chǎn)物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。2〕樣品DNA打斷：樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800bp的片段；對于小分子的非編碼RNA，這一步驟那么不需要。短的PCR產(chǎn)物那么可以利用GS融合引物進展擴增后直接進展步驟4)的工作。3〕銜接子連接：借助一系列標準的分子生物學技術(shù)，將A和B接頭〔3’和5’端具有特異性〕連接到DN**段上。接頭也將在后繼的純化，擴增和測序步驟中用到。圖中僅僅顯示了后續(xù)步驟中要用到的單鏈的DN**段。GSFLX系統(tǒng)的操作過程4〕一條DNA片段＝一個磁珠：接頭使成百上千條DN**段結(jié)合到它們自己唯一的磁珠上，此磁珠被單個油水混合小滴包被后，在這個小滴里進展獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響；整個DN**段進展平行擴增。5〕一個磁珠＝一條讀長：經(jīng)過PCR擴增后，每個磁珠上的DN**段擁有了成千上萬個一樣的拷貝。經(jīng)過富集以后，這些片段仍然和磁珠結(jié)合在一起，隨后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后繼測序使用了。6〕數(shù)據(jù)讀取和分析工具：GSFLX系統(tǒng)在7.5小時的運行當中可獲得40多萬個讀長，讀取超過1億個堿基信息。GSFLX系統(tǒng)提供三種不同的生物信息學工具對測序數(shù)據(jù)進展分析，適用于不同的應用：例如多達3GB序列的重測序，比照參考序列進展的擴增產(chǎn)物差異分析，及120MB的從頭測序工作等。備注

焦磷酸測序(pyrosequeneing)是通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應，促使熒光素發(fā)光并進行檢測的測序技術(shù)。既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的單核昔酸多態(tài)性(single年nueleotidepolymohism，SNP)檢測及等位基因頻率測定。焦磷酸測序是由DNA聚合酶(DNAPolymerase)、三磷酸腺酰硫酸化酶(ATPsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應體系的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，反應底物為5’磷酰硫酸(adenosines5’phosphosuifate，ASP）備注

和熒光素。反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應中，加人1種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻人到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，并由PyrogramMT轉(zhuǎn)化為一個峰值，其高度與反應中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加人dNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板DNA的核昔酸序列。DNA序列分析DNA雜交測序法(SBH-Sequencingbyhybridization)如果一段較短的DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈構(gòu)造，那么可認為靶DNA上存在著相應的互補序列，這就是DNA雜交測序法的根本原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機合成的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種8-mer的探針群體中，僅有5種探針會與靶DNA雜交，形成完全互補的雙鏈分子。DNA雜交測序法SBH的應用：

①可有效檢測靶DNA中的單堿基突變；

②可用于不同DNA片段之間的序列比較；

③可用于檢測不同生長發(fā)育狀態(tài)下細胞中特定基因的表達狀況；

④可用于檢驗傳統(tǒng)測序技術(shù)的準確性。蛋白質(zhì)研究技術(shù)Western免疫印跡將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進展檢測。對表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進展檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合局部的抗體檢測。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針〞是抗體。經(jīng)過PAGE別離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體〔如硝酸纖維素膜〕上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且保持電泳別離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反響，再與酶或同位素標記的第二抗體起反響，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳別離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。WBPCR應用1.PCR技術(shù)的原理無細胞克隆法：以擬擴增的DNA片段為模板，一對分別與模板互補的寡核苷酸為引物，在4種脫氧核苷酸〔dNTP〕存在下，由DNA聚合酶在引物所結(jié)合的位置向3’方向合成新的互補鏈。其反響以雙鏈DNA的變性、退火、延伸為一個循環(huán)。經(jīng)過屢次循環(huán)〔25-30次〕，便目標DNA片段得以大量擴增。由于每一次循環(huán)所產(chǎn)生的新鏈均可成為新的模板用于下一輪循環(huán)，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加。Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈式反應示意圖(e)(f)(g)預變性(93-95C,2-5m)變性(93-95C,30s)復性(50-70C,30s)延伸

(75C,30-60s)總延伸

(75C,7m)(25-35)PCR的一般過程：經(jīng)過