第二節(jié)植物細胞工程

第二節(jié)植物細胞工程第1頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)展歷史19世紀30年代Schwann和Schleidn創(chuàng)立細胞學(xué)說，認為植物和動物都是由細胞構(gòu)成。1943年，美科學(xué)家White正式提出植物細胞具有全能性的學(xué)說，認為每個植物細胞具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。1934年，荷蘭植物學(xué)家Went等發(fā)現(xiàn)了生長素，隨后又發(fā)現(xiàn)了其它生長素。1948年，斯科克等較好地解決了如何從離體組織或器官中誘導(dǎo)植物再生的問題，并確定了腺嘌呤/生長素的比例是控制芽和根形成的一個重要條件。第2頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月1953年，Muir開創(chuàng)了建立單細胞無性繁殖的工作。1956年，Miller發(fā)現(xiàn)了激動素1958年，Steward等從胡蘿卜根韌皮部愈傷組織獲得單細胞，并經(jīng)誘導(dǎo)形成胚狀體再生了植株，這是世界上首次通過實驗證實了植物細胞具有全能性。20世紀六十年代中后期，植物組織培養(yǎng)進入大規(guī)模的應(yīng)用階段。1960年Morel采用蘭屬的莖尖培養(yǎng)，實現(xiàn)了去病毒和快速繁殖兩個目的；1975年Rosati從草莓花藥培養(yǎng)中獲得了小孢子發(fā)育的植株。羅宗洛和李繼侗是遠東植物培養(yǎng)的先驅(qū)。組織培養(yǎng)技術(shù)是我國農(nóng)業(yè)高新技術(shù)中最重要、最活躍的領(lǐng)域之一，被譽為第四次綠色革命。第3頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物組織與器官培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)是指在無菌條下，將離體的植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等）、組織（如花藥組織、胚乳、皮層等）、細胞（體細胞、生殖細胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽，或者長成新的完整的植株的一種實驗技術(shù)。特點：條件要求比較苛刻，整個培養(yǎng)過程需在無菌條件下進行，營養(yǎng)成分及激素濃度適當。第4頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月全能細胞能夠表達生物體基因組的任何一種基因，并能夠分化出該生物體內(nèi)任何一種類型的細胞，進而發(fā)育為一個完全相同的生物體。第5頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織外植體組織增生的細胞產(chǎn)生的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。這些細胞的大小、形狀、液泡化程度、胞質(zhì)含量、細胞壁特性等通常具有很大的差異。愈傷組織細胞是分化的，但還沒有形成組織上的結(jié)構(gòu)，因此愈傷組織培養(yǎng)過程中沒有明顯的組織或器官上的分化。愈傷組織可以用繼代培養(yǎng)的方式長期保存，也可以通過懸浮培養(yǎng)而迅速增殖用作無性系；也可以用作原生質(zhì)體培養(yǎng)時原生質(zhì)體的來源。第6頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月外植體植物組織培養(yǎng)時用來進行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質(zhì)體。第7頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月繼代培養(yǎng)愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)。第8頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞分化或形態(tài)建成多數(shù)情況下植物細胞或組織培養(yǎng)是希望得到再生植株，一般植物通過細胞或組織培養(yǎng)達到再生目的要經(jīng)過以下兩個步驟：

1）培養(yǎng)的植物細胞或組織的脫分化，形成愈傷組織。

2）有新形成的愈傷組織形成一些分生細胞團，隨后由其分化成不同的器官原基。第9頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物組織培養(yǎng)的基本步驟組織培養(yǎng)可分為植株、器官、組織培養(yǎng)。根據(jù)操作方式的不同可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)又可以分為振蕩培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)和靜止培養(yǎng)。第10頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)材料的采集（一）培養(yǎng)材料的采集植物具有全能性的細胞有三類：1）受精卵2）雌雄配子體及單倍體細胞3）發(fā)育中的分生組織細胞第11頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）培養(yǎng)材料的消毒先將材料用自來水沖洗干凈，最后一遍用蒸餾水沖洗，再用無菌紗布或吸水紙將材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小快。在無菌環(huán)境中將材料放入70%的酒精中浸泡30-60s。再將材料移入漂白粉飽和液或0.01%升汞(HgCl2)中消毒10min。取出后用無菌水沖洗三四次。第12頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月制備外植體在無菌的環(huán)境下，將已消毒的材料用無菌刀、煎、鑷子等剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮或種皮胚乳（葉片則不需剝皮），然后切成0.2-0.5cm厚的小片。在操作中嚴禁用手觸摸材料。第13頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月接種和培養(yǎng)接種：在無菌環(huán)境下，將切好的外植體立即接種在培養(yǎng)基上，每瓶接種4-10個。封口：接種后，瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口。溫度：培養(yǎng)基大多應(yīng)保持在25度左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區(qū)別對待。增殖：在新梢等形成后需繼代培養(yǎng)。把材料分株或切段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中（增殖培養(yǎng)基一般在分化培養(yǎng)基上加以改良），增殖1個月左右后，可視情況進行再殖。第14頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）根的誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側(cè)芽一般沒有根，必須轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。一個月后即可獲得健壯根系。第15頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（六）組培苗的移苗移載試管苗進入自然環(huán)境前必須進行煉苗。一般先將培養(yǎng)容器打開，于室內(nèi)自然光照下放三天，然后取出小苗，用自來水把根系上的營養(yǎng)基沖洗干凈，再栽入已準備好的基質(zhì)中（基質(zhì)使用前最好消毒）。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的濕度，但要防止亂苗。第16頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物組織培養(yǎng)程序第17頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月一.植物組織培養(yǎng)

外植體愈傷組織新植株第18頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）實例：非洲紫羅蘭的組織培養(yǎng)第19頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織培養(yǎng)的基本過程（一）愈傷組織的形成（1）啟動期：細胞或原生質(zhì)體準備分裂的（2）分裂期：開始分裂不斷增殖自細胞的過程。（3）分化期：細胞內(nèi)部開始一系列形態(tài)和生理上的變化，分化出形態(tài)和功能不同的細胞。第20頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）愈傷組織的生長不斷更換新鮮培養(yǎng)基可以保持愈傷組織長期生長旺盛。第21頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織的分化和形態(tài)發(fā)生愈傷組織可以再分化成為芽和根的分生組織并由其發(fā)育成完整植株。第22頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月愈傷組織培養(yǎng)事例（1）蘆薈（2）海帶第23頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物器官培養(yǎng)植物器官培養(yǎng)是指從植株上的各種器官從母體上分離出來，放在無菌的環(huán)境中讓其進一步發(fā)育，最終長成幼苗的過程。相比于細胞或組織培養(yǎng)而言，植物器官的培養(yǎng)更為復(fù)雜。第24頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用（1）無性系快速繁殖技術(shù)試管甘蔗、試管香蕉（2）獲得無病毒植株（3）新品種選育突變育種原生質(zhì)體融合和細胞雜交花藥、花粉培養(yǎng)與單倍體植株（4）基礎(chǔ)研究上的應(yīng)用（5）種質(zhì)資源的保存（6）人工種子的獲得第25頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是人工種子？就是最外面包裹一層有機膜的植物胚狀體。人工種子的優(yōu)勢：（1）利用人工種子進行快速繁殖便于運輸和貯藏。（2）按要求配置，效率更高。（3）可以固定雜種優(yōu)勢，加速良種繁育。（4）可作為植物基因工程和遺傳工程的橋梁。（5）可保存珍貴品種第26頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月選取目標植物從合適的外植體誘導(dǎo)愈傷組織把愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基愈傷組織在液體培養(yǎng)基中增生擴大愈傷組織轉(zhuǎn)移到無激素培養(yǎng)基體細胞胚包裹人工種皮溫室（大棚）播種獲得目標植物第27頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月人工種子制作過程中，包埋是非常重要的環(huán)節(jié)1）對所要包埋的胚乳無傷害2）有足夠的的柔軟性，可以保護胚乳，并容許其發(fā)育。3）具有一定硬度，避免運輸、操作過程中的傷害。4）具有穿透性，傳遞細胞生長所需要的營養(yǎng)；并能容納其他附加成分，如防腐劑、殺蟲劑等。5）可以用現(xiàn)有的溫室或農(nóng)機進行播種。海藻鹽酸常作為人工種子的包埋劑。第28頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月人工種子的包埋方法主要有如下四種：復(fù)合凝聚：指兩種帶相反電菏的電解質(zhì)在水中相互作用形成多聚體包被溶液。界面聚合：在兩相界面處因溶解度低而成膜。離子交換凝膠：經(jīng)過離子交換而形成絡(luò)合物成為凝膠。變溫凝膠：高溫下為液體，低溫下為固體。第29頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物組織與器官的生物反應(yīng)器培養(yǎng)毛狀根培養(yǎng)：芽的培養(yǎng)體細胞胚的培養(yǎng)第30頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物組織與器官培養(yǎng)存在的問題（一）研究中存在的問題：植物組織與器官培養(yǎng)涉及許多學(xué)科，如細胞、分子、形態(tài)、解剖、生理、生化、發(fā)育、病理、遺傳以及育種等。對于培養(yǎng)較困難的植物缺乏研究。技術(shù)上的問題：效率偏低、操作比較煩瑣、培養(yǎng)結(jié)果比較難以確定等技術(shù)問題還沒很好解決。應(yīng)用范圍窄生物反應(yīng)器技術(shù)還不成熟。第31頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)是指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。其理論基礎(chǔ)是植物細胞具有全能性。第32頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞培養(yǎng)的方法根據(jù)培養(yǎng)對象，植物細胞培養(yǎng)可以分為單細胞培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。單倍體培養(yǎng)主要指花藥培養(yǎng)。按照培養(yǎng)系統(tǒng)可分為懸浮培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)等。第33頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基植物細胞培養(yǎng)基比動物的簡單，主要由無機鹽、碳源、維生素、植物生長激素、有機氮源、有機酸和一些復(fù)合物組成。無機鹽類：濃度為25mmol/L左右。必須有鉀元素，濃度為20mmol/L或更高。碳源：蔗糖或葡萄糖是常規(guī)的碳源，果糖差一些。第34頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物生長激素：生長素或細胞分裂素。生長素促進細胞分裂，促使根形成；IAA，2，4-D，NAA，IBA。細胞分裂素是BA和玉米素。有機氮源：主要有蛋白水解產(chǎn)物，谷氨酰氨或氨基酸混合物。有機酸：復(fù)合物質(zhì)：椰子汁第35頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基的準備高純度的藥品應(yīng)用蒸餾水或高純度的去離子水調(diào)pH值高溫滅菌（1200C15-20min）某些藥品需用過濾除菌需配高濃度母液第36頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物單細胞培養(yǎng)主要是觀察細胞個體是如何進行分裂、分化、生長及發(fā)育為大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。單細胞制備方法：機械化：效率低，獲得的細胞數(shù)量有限。酶解法：最為有效的一種獲得單細胞的方法?？捎脕碇苽湓|(zhì)體。愈傷組織誘導(dǎo)法：第37頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月單細胞培養(yǎng)方法平板培養(yǎng)法：將一定量細胞接種到或混合到裝有一薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)進行培養(yǎng)。具體步驟為：1）單細胞懸浮液的制備并記數(shù)；調(diào)節(jié)細胞密度；澆平板；接種培養(yǎng)?？醋o培養(yǎng)和飼養(yǎng)層培養(yǎng)法（1）看護培養(yǎng)：看護培養(yǎng)由Muir于1953年創(chuàng)立，是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續(xù)分裂和增殖的一種培養(yǎng)方法。這快愈傷組織被稱為看護組織。具體方法是將單個細胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織之上培養(yǎng)。優(yōu)點是簡便、成功率高。缺點是不能在顯微鏡下直接觀察。第38頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月飼養(yǎng)層培養(yǎng)：是用處理過的無活性的或分裂很慢，不具備分裂代謝能力的細胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。液體潛層靜置培養(yǎng)法：將一定密度的懸浮細胞放在培養(yǎng)皿中形成一淺薄層，封口靜止培養(yǎng)。優(yōu)點是易于補加新鮮培養(yǎng)基，可以鏡檢。細胞懸浮培養(yǎng)法：細胞接種于液體培養(yǎng)基中，在保持良好的分散狀態(tài)情況下培養(yǎng)。第39頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月懸浮培養(yǎng)的細胞優(yōu)點是：能大量提供比較均勻的細胞。細胞營養(yǎng)吸收、環(huán)境條件好，細胞增殖快。適合大規(guī)模培養(yǎng)，生產(chǎn)有價值的活性代謝產(chǎn)物。細胞生長測定的方法有：細胞記數(shù)細胞體積細胞鮮重和干重第40頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月懸浮細胞培養(yǎng)的同步化方法物理方法：體積選擇法和冷處理法化學(xué)方法：饑餓法、抑制法和有絲分裂抑制法第41頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞的保存繼代培養(yǎng)保存法低溫保存法冰凍保存第42頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物原生質(zhì)體培養(yǎng)將植物細胞壁除去后得到的裸露的球形細胞,即為原生質(zhì)體.特點:無細胞壁障礙,可以方便地進行有關(guān)遺傳操作,并且對膜和細胞器等進行研究.具有全能性,并能進行人工培養(yǎng)發(fā)育成完整植株.原生質(zhì)體適合進行誘導(dǎo)融合形成雜種細胞.第43頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月科研和生產(chǎn)用途提供生理生化研究的材料.用作研究基因調(diào)控和表達,遺傳工程研究的材料.進行原生質(zhì)體融合,建立雜交品種;同時可研究染色體行為和基因定位等.進行細胞器的分離,或進行相關(guān)細胞器的遺傳實驗.第44頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月原生質(zhì)體的制備1)原生質(zhì)體的來源:葉片,根尖,花粉和愈傷組織原生質(zhì)體的分離:機械化和酶解法原生質(zhì)體的純化:過濾-離心法漂浮法沉降法和漂浮法結(jié)合第45頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月原生質(zhì)體鑒定與活力測定原生質(zhì)體鑒定:

低滲爆破法:

熒光染色法:綠色熒光顯示纖維素的存在,紅色是真正的原生質(zhì)體.原生質(zhì)體測定:染色法:FDA,酚藏花紅,EvansBlue,胞質(zhì)環(huán)流法滲透壓變化法氧電極法第46頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月原生質(zhì)體培養(yǎng)液體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法第47頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生(1)細胞壁的再生(2)分裂(3)愈傷組織和胚狀體的形成(4)植株再生兩個途徑:愈傷組織誘導(dǎo)誘導(dǎo)胚狀體(胡蘿卜原生質(zhì)體培養(yǎng))第48頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞雜交（細胞融合）:將兩種植物的體細胞融合成一個雜種細胞；通過組織培養(yǎng)技術(shù)將雜種細胞培育成新植物體1960年英國諾丁漢大學(xué)Cocking教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用真菌纖維素酶，成功地制備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細胞原生質(zhì)體,開辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。

植物細胞雜交的主要過程如下：

1.原生質(zhì)體的制備。

2.原生質(zhì)體的融合

。

3.雜合體的鑒別與篩選

。第49頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物體細胞雜交過程圖第50頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月誘導(dǎo)植物細胞融合的方法物理法：離心、振動、電刺激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）第51頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

實例番茄-馬鈴薯煙草—海島煙草白菜—甘藍胡蘿卜—羊角芹

打破了遠緣生物不能雜交的屏障，提供了創(chuàng)造新物種的可能。意義第52頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月工業(yè)化植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有兩大類：

懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

第53頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞兩相培養(yǎng)技術(shù)兩相培養(yǎng)技術(shù)是指在培養(yǎng)體系中加入水溶性或酯溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細胞在水相中生長，合成的次生代謝物質(zhì)分泌出來后轉(zhuǎn)移到有機相中。建立植物細胞的兩相培養(yǎng)系統(tǒng)必須滿足以下條件：第54頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）添加的有機物或多聚化合物對植物細胞無毒，不會影響細胞的生長與產(chǎn)物的合成。（2）產(chǎn)物能比較容易的被有機物吸收或溶解于有機相中。（3）兩相之間容易分離。（4）有機物或多聚化合物不能吸收培養(yǎng)基中的有效成分。第55頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞的生物反應(yīng)器固定化培養(yǎng)細胞固定化是指游離的細胞包埋在多糖或多聚化合物制備的網(wǎng)狀支持物中、培養(yǎng)液呈流動狀態(tài)進行無菌培養(yǎng)的一門技術(shù)。植物細胞固定化方法：凝膠包埋、表面吸附、網(wǎng)格或泡沫材料固定、膜固定。固定化細胞的活力測定：染色法呼吸強度測定細胞生長速率的測定第56頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細胞的生物反應(yīng)器大規(guī)模培