瓊脂糖凝膠電泳詳細(xì)過(guò)程與步驟凝膠電泳加樣-課件

瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectrophoresis2020/12/121

天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉是從石花菜及其它紅藻類(lèi)植物提取出來(lái)的一種線狀高聚物。

瓊脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷D-半乳糖2020/12/122精品資料你怎么稱呼老師？如果老師最后沒(méi)有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒(méi)有學(xué)問(wèn)無(wú)顏見(jiàn)爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥(niǎo)說(shuō)早早早……”

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲2.對(duì)蛋白質(zhì)吸附極微，故無(wú)拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來(lái)分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測(cè)定6.樣品易回收，常用于制備。瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)2020/12/125缺點(diǎn)1.機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。2020/12/126一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定。2020/12/127瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。溴化乙錠（EthidiumBromide,

EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。2020/12/128三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品質(zhì)粒DNA樣品。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。瓊脂糖，1XTBE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液四、實(shí)驗(yàn)步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）2020/12/129⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。⑸打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。2020/12/1210⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到發(fā)出熒光的DNA條帶。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。2020/12/12112020/12/12122020/12/12132020/12/12142020/12/12152020/12/12162020/12/12172020/12/12182020/12/1219123M2020/12/12201、DNA分子的大小

雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)近似成反比；

2、瓊脂糖濃度

濃度越低，相同核酸分子遷移越快；

3、DNA的構(gòu)象

同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀DNA的遷移速率決定因素2020/12/12214、凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加。5、所用的電壓

低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。6、瓊脂糖種類(lèi)

常見(jiàn)的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；2020/12/1222

不同類(lèi)型瓊脂糖的性質(zhì)

瓊脂糖類(lèi)型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃

標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90

高強(qiáng)度瓊脂糖34~4385~95

修飾的低熔點(diǎn)/凝點(diǎn)瓊脂糖25~3563~653565

超低熔點(diǎn)8~1540~45

低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖25~3070388530752020/12/1223不同類(lèi)型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)(kb)高強(qiáng)度(kb)低熔點(diǎn)(kb)低黏度低溶點(diǎn)(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.12020/12/1224常用的電泳緩沖液4℃保存?zhèn)溆?7、電泳緩沖液2020/12/1225TAE和TBE電泳緩沖液比較都是常用電泳緩沖液，二者相比：1）TAE的緩沖容量較低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽(yáng)極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE中遷移快10%；4）對(duì)于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。2020/12/1226凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過(guò)程；3）其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。2020/12/12276×凝膠載樣緩沖液類(lèi)型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰15%聚蔗糖(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液2020/12/1228瓊脂糖凝膠中DNA的檢測(cè)

通過(guò)染色,紫外燈下檢測(cè)。主要采用溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法。2020/12/12292020/12/1230使用EB染色注意事項(xiàng)（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)（2）EB可用來(lái)檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸（3）EB使用時(shí)的配制、貯存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無(wú)EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。2020/12/1231凝膠中DNA的成像

可以用透射或入射紫外光對(duì)EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。2020/12/1232關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)技巧和方法\幾點(diǎn)注意事項(xiàng)1）加樣時(shí)槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會(huì)整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。2）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。3）應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時(shí)樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。4）在實(shí)驗(yàn)加樣中不一定每一個(gè)樣品都換一個(gè)槍頭，可在陽(yáng)極槽中反復(fù)吸打電泳緩沖液以清洗。（對(duì)于Southern印跡轉(zhuǎn)移和需要回收DNA片段的電泳，則應(yīng)該每一個(gè)樣品用一個(gè)槍頭加樣，避免樣品交叉污染。）2020/12/12335）凝膠中加入EB進(jìn)行電泳，便于紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會(huì)導(dǎo)致線形DNA遷移率