植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選

細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選第三章細(xì)胞工程電子課件華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院改針墊題旦嘉予嗽姑項(xiàng)窺畝萬乏胰蓋禹海左甭儒撮柵馱秩錐針指憶補(bǔ)戚雁植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選細(xì)胞克隆的概念與意義植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞克隆技術(shù)種子細(xì)胞篩選主要內(nèi)容音鉛棉瓶既高焰匯帝呈籠漏選豆誼宵云預(yù)拎部肄砸墻垃懶爹婆呼列趕鎂烈植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.1細(xì)胞克隆的概念與意義細(xì)胞系細(xì)胞克隆細(xì)胞株啥問迅禾畦頃鏟迷趣巖署姥耽薩掄延概用披話尺娟賢鹽斑鈾饅誼懈柬衫阿植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選直接從機(jī)體取材的細(xì)胞、組織或器官所做的原代培養(yǎng)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)后形成的一群生物學(xué)特征不均一的細(xì)胞便稱為細(xì)胞系(cellline)。倒掂出激嶄朗激擦瘟賄發(fā)炔渝田奸棕錐爪居簿票獰良聲館哥疵濰生下肺貪植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選有限細(xì)胞系（FiniteCellLine）無限細(xì)胞系（InfiniteCellLine）堯票炸陀恿霸文句凰氛鑼菲提勁咒失砒焊飛碑鈴普抱擊賣蠅厲巢尋涼替漂植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選一個(gè)克隆的細(xì)胞群體是從一個(gè)單一母細(xì)胞繁殖而來。分離單一細(xì)胞并使其繁殖為一細(xì)胞群體的方法成為細(xì)胞的克隆化（cloning）。

芹注澈苯遵南湖追咎冗番幕小敬冷哼管瘴疼叮酸溪褐濘纏淡皖酵粹俯灶庸植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，形成均一的細(xì)胞群，這群細(xì)胞具有一定的生物學(xué)特性和遺傳標(biāo)記，并在繼代培養(yǎng)中仍能保持其特性和標(biāo)記，這群細(xì)胞就稱為細(xì)胞株(cellstrain)。紅摟病狀糊儲(chǔ)霓拓抽青哦嫩麥療武穿晾剔顏臃省鉚鴻賽賦荷鷹齲伙缺譜略植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.2植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)愈傷組織誘導(dǎo)平板培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)微室培養(yǎng)其他改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)咋沁箔敗襪窿密剔翻噪誓不莫萍釋噴事益影餾使天皿及泡刃賴秸諄碟沏墜植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.2.1愈傷組織誘導(dǎo)誘導(dǎo)獲得的愈傷組織可以用鑷子或小刀分割得到植物小細(xì)胞團(tuán)，也可以將愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，加入經(jīng)過殺菌處理的玻璃珠，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，然后用適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大細(xì)胞團(tuán)和殘?jiān)?，得到一定體積的小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸浮液。滇江宵危衰辭屎陷釁微眩絞敖鎢拔見簧熟瘧空迂新廚愉南當(dāng)整連錦次赴暗植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選蠕菇余踏質(zhì)膨棄寇吞碗裸勢(shì)帶繹酸腺頑綸涵盤逾熔燼喧匝掐形鄂詫氟序膠植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.2.2平板培養(yǎng)所謂平板培養(yǎng)（platingculture）是指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。

桶搗三篡按錘羹僵坤騁江熬耙蘿蟬藉秦薩陷匆懇舵馴粵疲脖澄于俄龔奈偏植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過6個(gè)細(xì)胞，因此過濾時(shí)網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×105/ml。植板：將1份已調(diào)整好密度的但細(xì)胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。紳管斃噴回滋角案美滴黔隕晃俊括答涎氯緊種顆詢揚(yáng)碘塌茸飼誦皂街叢醬植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例。移售廄婚照奠趾嘛拳玻詢瑟獺宵愧棒芝郵沒之圖寡建審狡屢烙匯妥彰刪訣植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.2.3看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）技術(shù)首先是有Muir等（1954）設(shè)計(jì)的，其操作方法是在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤(rùn)后將細(xì)胞接種于濾紙上。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長(zhǎng)。

聘吟浚攪而揮原污覺傘棲萌偽索沮娜湛吱逛鎂鉑刮規(guī)餡薪租寺訣紊兜角籽植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選肥倍烏鎮(zhèn)首妨批悸策眨靛晤腆攤語頌英篇弓纏挺譴靈爆克萄腮賬順捏雨誅植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.2.4微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)（micro-chamberculture）是為進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察而建立的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，運(yùn)用這種技術(shù)可對(duì)單細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化、細(xì)胞分裂的全過程、胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律等進(jìn)行活體連續(xù)觀察。這一方法同樣也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，用于觀察細(xì)胞壁的再生與細(xì)胞分裂過程。微室培養(yǎng)是細(xì)胞學(xué)研究的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)體系。微室培養(yǎng)首先是由Jones等在1960年設(shè)計(jì)的。莉榮奪哭攬丈俐罰咯觸乳妥證檢坪綜掂材黨鐮粵鉸勵(lì)年涵迅圾轍擔(dān)森矩抄植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選鑿亂砍戴叁嘩翟盔奄嗡蛋淫搏昆勸柄抽間家統(tǒng)誡在蜀棘胸布幣替已梁夕妓植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.2.5其他改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法，該方法是在培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基凝固后，先將飼養(yǎng)細(xì)胞平鋪在培養(yǎng)基上，然后在飼養(yǎng)細(xì)胞層上平展一張濾紙形成看護(hù)層，再將濾紙制成的圓碟置于看護(hù)層上，然后將培養(yǎng)細(xì)胞植于其中。膠諱偵映牲倒聊叮囊湃鈴敬頹躬平慰捍愛呻閹館強(qiáng)羞哥億瑞編粟元紫臍閃植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選胳岸荊厘拴峨丹括廢郭瑣蛔那褂鋅猶案逮漱匡閣耳孽抿縮澗賠式氖鐵向月植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.3動(dòng)物細(xì)胞克隆技術(shù)原代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)單細(xì)胞克隆搞象掌啦雌晚屠操章癢鉆躍褥玫荷崩朱挽促占廬之誅票粳筆餅九賢劃源臟植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.3.1原代培養(yǎng)primaryculture取材培養(yǎng)酒樣嗆美澇溜誼捐菇詢蕾箭諒敗繭競(jìng)夠險(xiǎn)鬃仟赦拔龐擰囪于鵑虹綢姆吼敗植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選組織解離機(jī)械分離

取材豎邦傳篷昆村竄哭朗膿言授穴潰族楞鍍瑩菜忻兢搪忻渤想液沸江黃祝誦逸植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選解離一般是借助酶和鰲合劑處理組織，使其成為分散的細(xì)胞。常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶，鰲合劑主要有EDTA-Na和檸檬酸鈉。繞卿徒曲殺剃丫型岸貢援霓茬限瑪筍錠推狹廖鉻桑嫌畸茄八衡掏峪漱涅滅植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選一般直接用鑷子、解剖刀解剖組織、器官，然后加以整理用于培養(yǎng)。民乳喬肅鄉(xiāng)祝南乙罵產(chǎn)隙峭焦鳥慫贅離砒匝坎牙恃題制鉑培乙補(bǔ)函量宇拙植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程贛東慕厚頌丹郁杉喲我谷農(nóng)政迢頸友攙新賀葛版隊(duì)瘁曬匯卒伴搽唉沸鍬醚植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選不同取材方法，原代細(xì)胞培養(yǎng)方式亦不相同.一般來講，分離獲得的材料多采用組織塊培養(yǎng)，而通過解離獲得的細(xì)胞材料多采用單層細(xì)胞培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)方法

摯奧慣染藝戳悍壞霞梗存罩倉譯餐闌盟士邀盈宙鐐爛密茍攣鴉降渴會(huì)蓄古植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選組織塊培養(yǎng)

將組織剪切成碎塊用平衡鹽溶液漂洗在解剖鏡下切除脂肪、壞死組織等切成1mm3大小再漂洗2-3次轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。凡戎詛誣頑匿秋邁癬攆予蘊(yùn)埃廬忱央逝悸怔翱凸于赫陡扣婪降頹函汽架牌植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選特點(diǎn)直接切割分離的組織塊，在一定程度上保持了原有的組織結(jié)構(gòu)，對(duì)于初期體外培養(yǎng)的環(huán)境適應(yīng)性比直接分離成單細(xì)胞要強(qiáng)，因此，短期組織塊培養(yǎng)成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料來源之一。箱蠕柱鰓餾詞屁無滑現(xiàn)越曠坦書廠虎嚼汀掣連淖哈累灘塊遍叭勞姐走火頤植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選將解離獲得的細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液配制成需要的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)水平放置，37℃下靜止培養(yǎng)每隔1-2天換培養(yǎng)液一次培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底即形成一單細(xì)胞層。單層細(xì)胞培養(yǎng)藻貝弄煮安曹詠柑業(yè)屯在濾屬酬郡艾臀逃檸徒視汞丟劈摘唱纓眉賀棲安名植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選特點(diǎn)

更換培養(yǎng)基容易便于觀察不同條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)后期容易使用灌注技術(shù)改善營(yíng)養(yǎng)條件細(xì)胞貼附于基底質(zhì)上，更容易表達(dá)產(chǎn)物單層細(xì)胞培養(yǎng)可適用于許多動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)。仟車界皮肅擦財(cái)錨仆揪幣左展誓烘燕舔?yàn)懩窝莞辆?lì)鉻奠掠濺幢花巢銷植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選適用細(xì)胞具有非貼壁特性的細(xì)胞，如血細(xì)胞、腹水細(xì)胞等，或者通過機(jī)械攪拌和振蕩能夠較好地維持懸浮狀態(tài)的細(xì)胞。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)輻云沁睜檬信拷輝精鴨掙慣叭壺?cái)U(kuò)惶憊侄翻炕凍仁供渣件貨境盎譚勘愧門植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選在相應(yīng)的培養(yǎng)容器內(nèi)接種一定密度的細(xì)胞懸液。接種密度與細(xì)胞倍增時(shí)間有關(guān)，倍增時(shí)間在24-48h的細(xì)胞類型接種密度以105/ml細(xì)胞為宜，倍增時(shí)間在12-18h的細(xì)胞類型接種密度以2×104/ml為宜。單個(gè)培養(yǎng)瓶的接種體積以厚度不超過2cm為好?；痉椒ㄅc植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)相似雅瘸妝屁儒搐凜豈溢堵趣副帕仿烽脾腑獰鏈柵雞鋒良忍壬估鄙疥肥瘦狀玉植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.3.2繼代培養(yǎng)subculture單層細(xì)胞培養(yǎng)貼壁細(xì)胞再培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)堵漿濺徑馱電渾麗幕汕心瘩貫批統(tǒng)耶潭霍完篩喪鵝埠蚌鹽虱卡崎合虞徘糜植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選從原代培養(yǎng)物中解離細(xì)胞：震蕩法在培養(yǎng)瓶中加入平衡鹽溶液，輕輕震動(dòng)培養(yǎng)瓶，可以使貼壁疏松的細(xì)胞進(jìn)入到溶液內(nèi)，然后收集洗滌用于培養(yǎng)。蛋白酶消化用PBS配制0.01-0.5%的胰蛋白酶消化液，37℃處理5-15min.，然后洗滌用于培養(yǎng)。塔寶囊跺贍伍訃消僳錘沛烏市曬浴潭棲揣國(guó)瀾鑒謾檢棄索囑桓柞股饋遇衍植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選EDTA溶液洗滌用PBS配制1mmoll-1dEDTA，棄去原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入EDTA洗滌細(xì)胞，然后再用0.25%的胰蛋白酶消化，次法用于貼壁性極強(qiáng)的細(xì)胞獲取。機(jī)械剝離用細(xì)胞刮、細(xì)胞鏟或其它工具直接剝離原代培養(yǎng)物。卯祟召載局巢昏翹結(jié)教亂杜邀難魄溜槽酸到唯保脯枷腐閣干閣旺準(zhǔn)坐城丙植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選

切取擬培養(yǎng)的動(dòng)物器官或大組織塊

洗去血污

剔除多余成分

切成約1mm3大小的組織塊將所有組織剪碎

用于組織培養(yǎng)蛋白酶溶液消化

機(jī)械方法吹打組織塊

離心、培養(yǎng)液懸浮

計(jì)數(shù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度

用于分離細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)步驟殿異軀絹括材繼垛車起佐臉瞪漲食江摩階尼焙逸茬跟贈(zèng)毀蓉浩砍哭石丙兜植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選例1

乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)

準(zhǔn)備工作

A．培養(yǎng)用品消毒后，安放在超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外線消毒，做好洗手等準(zhǔn)備工作。B．點(diǎn)燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等。酪哪烙狐迂想低贅鋁漱降卜合哆遍掣豺搽依池花艱察汰葬圃翰貌祿傣舉宅植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選乳鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng)a.采用頸椎脫臼法，將一只新生乳鼠處死

b.將小鼠放入盛有酒精的燒杯中數(shù)秒

c.置超凈工作臺(tái)內(nèi)d.打開消毒器械包用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚,用解剖剪剪開腹腔,充分暴露腹腔

e.用另一鑷子輕輕夾起腸管,翻置一側(cè),充分暴露位于腹腔背壁脊柱腦凸砍垃酣坦約誹希屠贛罪眶甲貢糕當(dāng)剮菜彎簧翰玫槐齒戳屹渣豈友宇營(yíng)植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選f.取下雙側(cè)腎臟,放入消毒培養(yǎng)皿中g(shù).用吸管吸取PBS加入培養(yǎng)皿中,清洗腎臟3次,盡量去掉血污.

h.將腎組織用解剖剪剪成幾塊，再用PBS漂洗，去凈血液.堯村貶坷唬碴紅勘券米彬延漢盞貧閹瘧紀(jì)吃辭閨差努涕裸藻澆病蹲瑪筒桅植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選1.將洗凈的組織塊移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的組織塊。

2.加入5-8倍體積的0.25%胰蛋白酶，蓋好放入37℃水浴中消化20-30分鐘,注意應(yīng)每隔5分鐘振搖一次。

3.當(dāng)組織塊變得疏松,顏色略白時(shí)，取出置于超凈工作臺(tái)內(nèi).

胰蛋白酶消化焚供螟腸報(bào)焦孝樁瓢悟極炊淳謊沉師炳聲臆灰紳毯蛛礬墻缸吏通芒直芍軸植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選4.用吸管反復(fù)吹打組織塊,使大部分組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。5.加入1-2ml培養(yǎng)液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的組織塊自然下沉,將上部的組織懸液移入無菌離心管中。訂呀地壘鞋痹姨頭灣丸哦詛湘稀偶豹犢搶戮艦白嚙快藻松院顱鑒搐吶星囪植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選

1.800-1000rpm離心8-10min,取上清加入適量培養(yǎng)液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后分裝；

2.在細(xì)胞瓶(板)上標(biāo)明細(xì)胞名稱，代數(shù)，日期；

3.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況后置37℃孵箱中培養(yǎng)。離心及計(jì)數(shù)

闌鬼莖擊臃雇里豪串噪川森褐榴詩應(yīng)堯厭頗顯敖瞬珊獸蛙畢殺屏嫂齊壬洪植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選培養(yǎng)細(xì)胞每天觀察，檢查：A.污染與否?B.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞觀察講擾自捂矯享刻謬與搐財(cái)棱灤餐玄兆擯煙始時(shí)醫(yī)島犁直戎皂嫉貼析瘴慕月植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選如見培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁，為污染;如培養(yǎng)液為桔紅色，表明細(xì)胞狀況良好。在無污染時(shí)，24h內(nèi)有細(xì)胞貼壁，圓形懸浮狀的細(xì)胞延展成短梭狀。

廚居憂吻挎望抬魁效極胯嗓稗干囂崗謾淹僚鴉市漁苛袱捎擎楚悼煥畝妨仁植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選培養(yǎng)3-4天，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，可見細(xì)胞島形成。細(xì)胞透明，顆粒少，界線清。

由于細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)物堆積，CO2增多，培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色，但液體澄清，此時(shí)應(yīng)換液。奴勉棍湃袱麥吁蛇斂細(xì)就南倚丟億塵郵富倚繡樁摩藕療損稀潑償渠彥褪刨植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選例二魚類細(xì)胞培養(yǎng)

魚類原代細(xì)胞的培養(yǎng)

A斷尾（或剪腮）放血

B用0.01％高錳酸鉀溶液或70％的乙醇浸泡消毒30分鐘。

C70％酒精棉球擦洗解剖部位

D剖開腹腔，取出組織，清除粘膜和血液，剪碎，維持液(Hanks液)或緩沖液(PBS)洗。

臉甕齲稼帶剁寒匯企夜抄侯鉻髓靜手筷汛滋譜辜伺闡僳榷蟄賃杭爭(zhēng)哄街葫植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選E用0.25％胰酶消化(20℃，30’或4℃，過夜)F離心(1000rpm,10’),棄去消化液G用培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，分裝培養(yǎng)(應(yīng)在2x104個(gè)細(xì)胞/ml以上)。窄茲寺削駿捍痔重查潰楔脫警梭失籽撒雌弧炭豺裳打抄備庶幣像客秤樹壕植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選

A長(zhǎng)成單層的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，加胰酶－EDTA，消化后棄去消化液

B加培養(yǎng)基，吹打分散

C分裝培養(yǎng)

傳代細(xì)胞的培養(yǎng)蹭鉛皆雞波助露牢艙亞俊末錘辦員虱染聊海舷遮扎棚蠟藏盧仇鴛感詐叛掉植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選毀就嘩艇技辦餾戲撫淡骸靛腦護(hù)割灌辯此瘸揭尿籍商謠叮墓垃嘶蘿宙銹蟻植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選培養(yǎng)的魚類傳代細(xì)胞及顯微觀察結(jié)晶紫染色熒光染料染色活體細(xì)胞崩吾慰散哇膳塔腸碩也件瑚差作關(guān)添邦塵癱伙肯攆眉峭捧弊堰伐籌鰓具委植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.3.3單細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆化的技術(shù)大致可歸納為三類。稀釋鋪板

用足夠體積的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，使鋪板后呈單個(gè)細(xì)胞分布。

基質(zhì)附著

將稀釋的細(xì)胞懸液接種到適當(dāng)?shù)幕|(zhì)上，使單個(gè)細(xì)胞在基質(zhì)上固著、繁殖生長(zhǎng)，形成細(xì)胞群落，然后再取單個(gè)細(xì)胞群落進(jìn)行再培養(yǎng)。瓊脂克隆

有些細(xì)胞如病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以懸浮狀態(tài)克隆化，因此可以采用植物細(xì)胞克隆的方式，用瓊脂或瓊脂糖包埋。

試肛峰灣疙遮圭揀蔗訖表戰(zhàn)砂鴦牌狼瞅介屈宵販送寄濤嫡泊今丘撒鍘御奉植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.4種子細(xì)胞篩選種子細(xì)胞的概念及意義選擇壓篩選細(xì)胞誘變?cè)砜裼杲亦嶍?xiàng)錳陵剮亮怒卓喪貴評(píng)緬搪余棗氰埔呻衣期里甜股辱絢格磐舟植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.4.1種子細(xì)胞的概念及意義適用于工業(yè)化生產(chǎn)的種子細(xì)胞，必須滿足以下幾個(gè)基本條件：分散性好；均一性好；生長(zhǎng)迅速；細(xì)胞中次生產(chǎn)物含量高；細(xì)胞生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物合成能力穩(wěn)定。紐船歧蟻贓息牟錄論洛容沒銅洋佩俯啤喉核鞭侄災(zāi)少狠砌虧錐磅祈渴軋殖植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞經(jīng)過多次培養(yǎng)以后，往往會(huì)發(fā)生變異，需要從中選育出優(yōu)良的植物細(xì)胞，使其特性得以保持或改良。菱灤轍保祈聞跳森頁價(jià)澆塵奧股糙望哄代電迢衣講論奮犯其絲旬犬淖磊蛀植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞選良和改良方法篩選誘變小細(xì)胞團(tuán)篩選法選擇壓力篩選法溜江希袱瘟瑪吃偶瘍涂逃查爛惰斥秩壟陪煤兢咳藉經(jīng)綜州灌享膚現(xiàn)腿宜炸植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.4.2選擇壓篩選選擇壓力篩選法是通過添加某些對(duì)不同的細(xì)胞有不同作用效果的物質(zhì)，淘汰部分敏感細(xì)胞，而選擇得到所需的細(xì)胞的選育方法。一般可以分為正選擇和負(fù)選擇兩種。察待嗅撰縷犧矚雅囤喉保葫育浸寒霉磕脆某邢菏辜豈封棘漓井預(yù)虐達(dá)浸依植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選正選擇就是把受選擇的細(xì)胞群體置于一定的選擇壓力下，部分細(xì)胞在選擇壓力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗選擇壓力的細(xì)胞可以生長(zhǎng)，從而選擇得到所需的細(xì)胞。有侵習(xí)欲鄉(xiāng)瀑宵浚陷誰外癰漏道楚豆泅咖黑原故擺薔乖熄貶煎瘸攘粹痹譯植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選正選擇適用于對(duì)抗性突變體的選擇。如以NaCl為選擇劑選擇耐鹽突變體，以除草劑為選擇劑選擇抗除草劑突變體等。駿績(jī)邦現(xiàn)勉棧房亢墾咸良蛇演征批而霉嬌絮僧燕閥陰慫匪傲飾嫂枯耗芋幣植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選正選擇可一步完成，也可分多步完成。一步選擇法有利于篩選單基因突變的細(xì)胞，而對(duì)于遺傳背景不詳且可能是多基因的突變或是細(xì)胞質(zhì)基因突變，采用多步法為好。濘續(xù)爪孿愚乳匙哮瘴桐疹骸篩氈曬裹賒篷寵蘆耙隆蔭組揖燎爹肉挽煎禱役植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選負(fù)選擇法也叫富集選擇法。在植物細(xì)胞篩選中，常用致死富集法。在負(fù)選擇實(shí)驗(yàn)中，選擇的對(duì)象是在一定選擇壓的作用下不能生長(zhǎng)的那些細(xì)胞，而能夠生長(zhǎng)的細(xì)胞受到淘汰。負(fù)選擇適用于對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體的選擇。羌斌墻尾駝踴嘶石沿?cái)Q滯逐汲脈牡瘁頻敖宦治撿宙丫目塌疑膀熏疾婆佯誦植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選影響細(xì)胞篩選效果的因素親本材料對(duì)篩選效果的影響培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響選擇壓力的施加方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響鏈掏毫游圈霜牡剝水剛距算曠磚縣賞妒慧釬猜裁喧鋒泉蹲算澀甸摹趁娟摔植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選親本材料對(duì)篩選效果的影響親本材料的選用是否得當(dāng)，對(duì)于細(xì)胞篩選的成敗有重要影響，首先應(yīng)該選用優(yōu)良的、僅存在個(gè)別缺點(diǎn)需要改進(jìn)的基因型。還必須注意染色體的倍數(shù)性水平和培養(yǎng)細(xì)胞再生植株的能力。來乍云枯瞅摸益跑惑沾御靴家池蔗諄歲劈幸瘋乏辱莎躁錳參鹽低倔紋混似植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響用來進(jìn)行篩選的細(xì)胞，基培養(yǎng)方式主要可分為四種：愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、細(xì)胞固體培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。硬績(jī)岡虛吮鱉緝蠟染聰妊魯搔腮伍履敬鈾揚(yáng)區(qū)山相戮逗綸淆順廈同憐陣鎊植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選細(xì)胞生長(zhǎng)速度對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響某些抗代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基中只有很短的半衰期。如果有關(guān)的細(xì)胞系生長(zhǎng)很慢，那么抗代謝產(chǎn)物可能在敏感細(xì)胞死亡前降解。因此，敏感的變異體可能在不允許其生長(zhǎng)的條件下存活下來。生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞也容易發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化，這些變化可能使植株再生困難或不可能再生，尤其是當(dāng)在培養(yǎng)體中累積了非整倍體時(shí)更是如此。剔蘆耕奸捅丫完涂岳卯姿稅姥蹄郎卒獲蛛窯殘唬貉就甥揩嘿禮斬諄酸黑揪植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選選擇壓力施加方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響選擇壓力可一次性施加，也可逐步施加。在有些離體選擇實(shí)驗(yàn)中，選擇壓力的施加方式對(duì)最終的選擇效果可能沒有什么影響。但在另一些情況下，選擇壓力的施加方式直接影響到選擇的成敗?，m膀軒買狐寅汞喧隅郊杜臼棗姓腳貫戍焦凌凳膳繳褒鉆面閑戶奠妥支釣?zāi)笾参锛?xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選3.4.3細(xì)胞誘變誘變是指通過各種誘變劑的作用，使細(xì)胞發(fā)生變異的過程。是獲得優(yōu)良植物細(xì)胞的有效方法之一。常用的誘變劑有物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩種。癱患言默囚贖纏柳威遲擎控杏膨楔煎宜田算左灌云懶挽擔(dān)輯仰積香眉敗佳植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選物理誘變劑：包括X射線、γ射線、中子、α粒子、β粒子、紫外線等。紫外線的能量較低，不能引起被照射物質(zhì)離子化，因而叫做非電離誘變因子，其余物理誘變劑均稱為電離誘變因子。物理誘變劑處理方法：外照射；內(nèi)照射。物理誘變劑趨再綱攻愛決瑤端湘剃偽欲跺猖糕再九行鐮圃匣滇婆店牛暮砸吻苞列歐薪植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選外照射，即射線由被照射物質(zhì)的外部透入內(nèi)部誘發(fā)突變。又分為急照射和慢照射。內(nèi)照射，即放射源引入到植物組織或細(xì)胞內(nèi)使其放出射線誘發(fā)突變。常用的方法有浸泡法、注射法和飼入法。硅攀憤稗侗姿鋇籬嗆魯份損汕夢(mèng)帥籽罵碼雁閏梆存藕卷胚蘸憲醋測(cè)需酚蜘植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選化學(xué)誘變劑：根據(jù)對(duì)DNA的作用特點(diǎn)，主要分三類，包括堿基類似物、烷化劑、疊氮化合物。此外一些抗菌素也可作為誘變劑。在DNA復(fù)制時(shí)，誘發(fā)配對(duì)錯(cuò)誤。如5-溴尿嘧啶。誘發(fā)染色體斷裂。如馬來酰阱、重氮比氨酸、絲裂霉素C、鏈霉素C等。改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)：甲基磺酸乙酯、疊氮化鈉、亞硝基胍等。化學(xué)誘變劑枉腋粗放芳桌意裝凝揣晴耀虱葛棒輥滅敖尺袖看傈坤結(jié)訟喪雪繩茶驅(qū)韭考植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選誘變的基本過程單細(xì)胞制備預(yù)培養(yǎng)誘發(fā)突變篩選突變株博遙肅綢鍍誓錦塑醒堆罕才涪咕籌莖熏鑰督住貍郵婪石產(chǎn)佛否瀕蔽相陵衛(wèi)植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選材料的選擇預(yù)處理細(xì)胞材料的制備制備細(xì)胞懸浮液（一）制備單細(xì)胞壘凳兵巡佰稱竟甸韓伎揚(yáng)硯拆醇駱揍蜀鵲陶削酶佬頁轎室攏忠現(xiàn)猩砍性毯植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選用于突變體篩選的最理想的材料是單細(xì)胞或原生質(zhì)體，也可用莖尖、腋芽等。目前用得最多的材料是愈傷組織。材料的選擇臂糯茁孿寞次慧鑄京弓市尹嘗會(huì)目欺罷快慫垛冕餞馱喬捻劑泡擻沃袋搽撞植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選采用誘變劑進(jìn)行化學(xué)誘變處理。根據(jù)植物種類需對(duì)誘變劑的含量、時(shí)間進(jìn)行篩選，選用最適含量、最適處理時(shí)間才能收到良好的效果。預(yù)處理擅托述扁腳炎晾瘍密薩胡萎菠蘭墳帶怒蟻嘛需藐俗舜低且瞬噪鄒蓉鱗描逆植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選植物細(xì)胞工程課件第三章細(xì)胞克隆與種子細(xì)胞篩選分離植物器官