目的基因的獲取課件

目的基因的獲取1精選課件1、什么是目的基因2、目的基因獲取途徑3、PCR法制備方法及過程2精選課件一、什么是目的基因目的基因：是指基因工程操作中需要的外源基因，它是編碼某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，如生物的抗逆性基因、抗蟲基因等。從目的基因的概念來看，最原始的目的基因是指從某甲種生物體內(nèi)直接獲得，然后轉(zhuǎn)入已知的某乙種生物體內(nèi)并讓其成功表達(dá)以使乙種生物能表現(xiàn)甲種生物的某種特征的基因。3精選課件需要克隆的DNA片段編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系4精選課件二、目的基因的獲取化學(xué)合成法基因組DNA文庫(kù);cDNA文庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)直接從染色體DNA中分離5精選課件三、PCR擴(kuò)增獲得目的基因6精選課件1、PCR的含義聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeaseChainReaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。7精選課件PCR可以把

指定的基因片段

幾何放大染色體PCR

基因放大連瑣反應(yīng)8精選課件2、PCR的基本原理試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。9精選課件3、PCR的反應(yīng)過程1）、預(yù)變性：使模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)充分打開，讓DNA雙鏈充分解離,為了第一次退火過程時(shí)候引物可以盡量多的結(jié)合到模板上面。

一般的PCR反應(yīng)的預(yù)變性溫度是94℃或95℃，預(yù)變性時(shí)間一般設(shè)為3-5min。10精選課件2）、變性：使DNA雙鏈解離變?yōu)閱捂?。一?4℃～95℃，1min足以使模板變性若低于94℃則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。11精選課件3)、退火(復(fù)性)：使引物結(jié)合在模板上。退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。退火溫度，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長(zhǎng)度，一般在40-65℃之間。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃作為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。12精選課件引物的復(fù)性溫度的計(jì)算公式Tm（解鏈溫度）＝4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值－（5～10℃）；在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性；復(fù)性時(shí)間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。13精選課件4）、延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則不斷合成DNA片段。延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10kb需延伸至15min延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些14精選課件4、PCR的反應(yīng)過程演示15精選課件16精選課件17精選課件18精選課件19精選課件20精選課件21精選課件22精選課件23精選課件24精選課件25精選課件26精選課件27精選課件28精選課件5、PCR法克隆基因的技術(shù)流程設(shè)計(jì)引物提取基因組DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)進(jìn)行PCR反應(yīng)29精選課件5.1設(shè)計(jì)引物引物設(shè)計(jì)的原則：（1）序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。（2）引物長(zhǎng)度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。30精選課件（6）引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)（不能做任何修飾），5’端無(wú)嚴(yán)格限制。（7）引物5′端可修飾引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，但對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個(gè)堿基而對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)影響。31精選課件限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記3’5’3’5’32精選課件5.2提取基因組DNA模板DNA的來源：微生物中提取DNA植物中提取DNA從細(xì)胞中提取DNA：血細(xì)胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、精斑、口腔上皮細(xì)胞固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：0.1～2ug/100ul體系PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高模板DNA濃度過高導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加33精選課件5、3進(jìn)行PCR反應(yīng)34精選課件5、4PCR反應(yīng)體系與流程反應(yīng)體系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR緩沖液1.5～4mMMg2+0.2mMdNTP反應(yīng)流程預(yù)變性變性退火25～