食品生物技術(shù)概論-廖威-第五章-細胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用課件

1整體概述THEFIRSTPARTOFTHEOVERALLOVERVIEW,PLEASESUMMARIZETHECONTENT第一部分2第四章細胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用1、細胞工程概述2、植物細胞工程3、動物細胞工程4、細胞工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用實例3第一節(jié)細胞工程概述一、細胞工程發(fā)展史45請同學(xué)們討論如何實現(xiàn)?西紅柿—馬鈴薯？678細胞工程的基本技術(shù)

細胞工程是指以細胞為基本單位，在體外無菌條件下進行培養(yǎng)、繁殖或利用細胞融合、核移植等技術(shù)，使細胞某些生物學(xué)特性按照人們的意愿發(fā)生改變，從而改變生物品種、創(chuàng)造新品種和加速繁育生物個體，以及獲得某些有用的細胞代謝產(chǎn)物的技術(shù)。細胞工程植物細胞與組織培養(yǎng)細胞融合細胞核移植染色體工程動物細胞工程植物細胞工程微生物細胞工程按對象分類按技術(shù)分類9植物細胞與組織培養(yǎng)在無菌條件下分離植物細胞或組織，將其放在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，給予必要的生長條件，是他們在體外繼續(xù)生長、增殖與分化，形成新的組織、器官和個體的技術(shù)。10植物細胞與組織培養(yǎng)植物細胞與組織培養(yǎng)細胞融合細胞核移植細胞融合儀器采用自然或人工的方法使兩個或多個不同細胞融合成一個細胞的技術(shù)（標(biāo)記、制備原生質(zhì)體、誘導(dǎo)融合、篩選雜合細胞）。染色體工程11植物細胞與組織培養(yǎng)細胞融合細胞核移植染色體工程也叫細胞拆合，將有一個細胞的細胞核轉(zhuǎn)移到另一個去除細胞核的細胞中去，從而使受體細胞獲得新的遺傳信息，產(chǎn)生新的生命現(xiàn)象的技術(shù)。12植物細胞與組織培養(yǎng)細胞融合細胞核移植染色體工程

人們按照一定的設(shè)計，有計劃地削減、添加和替換同種或異種染色體，從而達到定向改變遺傳性狀和選育新品種的一種技術(shù)。13第二節(jié)細胞融合技術(shù)

細胞融合產(chǎn)生的背景細胞融合技術(shù)作為細胞工程的一項核心基礎(chǔ)技術(shù)已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展和應(yīng)用。細胞融合不僅為細胞的起源、核質(zhì)關(guān)系、肌肉骨骼胎盤的發(fā)育、腫瘤發(fā)生、干細胞介導(dǎo)的組織再生等理論領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、育種學(xué)、發(fā)生生物學(xué),特別是在單克隆抗體及動植物遠緣雜交育種方面具有重要意義。

14

細胞融合技術(shù)是20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的一項新興細胞工程技術(shù)，細胞融合(cellfusion)也稱細胞雜交(cellhybridization)、原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)或體細胞雜交(somatichybridization)是指兩個或多個相同或不同的細胞相互接觸后，其細胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程。15在自然情況下，體內(nèi)或體外培養(yǎng)細胞間所發(fā)生的融合，稱為自然融合。而在體外使用人工方法（使用融合誘導(dǎo)因子）促使相同或不同的細胞間發(fā)生融合，稱為人工誘導(dǎo)融合。人工誘導(dǎo)的細胞融合在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于這種技術(shù)不僅能產(chǎn)生同種細胞融合，也能產(chǎn)生種間細胞的融合，因此被廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。1617

18細胞融合的原理細胞膜的流動性是動物細胞融合的生物學(xué)基礎(chǔ)。動物細胞融合技術(shù)即是利用細胞膜的這一特性，通過對參與融合的細胞通過生物、化學(xué)或物理誘導(dǎo)因素，使細胞膜的脂類分子的有序排列發(fā)生變化；當(dāng)誘導(dǎo)因素解除后，細胞膜會回復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過程中便可誘導(dǎo)相接觸的細胞發(fā)生融合。1920一、誘導(dǎo)細胞融合的方法目前，誘導(dǎo)細胞融合的方法包括病毒、PEG、電泳沖和激光四種。其中，PEG誘導(dǎo)細胞融合和電誘導(dǎo)細胞融合是誘導(dǎo)動物細胞融合的常用方法。211、仙臺病毒法仙臺病毒又稱日本血凝性病毒，引起細胞融合的有效部位在于它的細胞膜成分，特別是磷脂成分，而與核酸活性無關(guān)。兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近。通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透，兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體，進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。22232、聚乙二醇（PEG）法PEG的作用機理是PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，使溶液中自由水消失，高度脫水，其結(jié)果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。PEG誘導(dǎo)融合時必須有鈣離子，磷酸鈣不溶于水，成為細胞間的鈣橋，由此引起細胞融合。24聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程253、電融合法（electricalmediatedcellfusionorelectrofusion）電融合法是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的細胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜出現(xiàn)微孔，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點是融合率高、重復(fù)性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強。當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串。原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。26

電融合誘導(dǎo)法原理示意圖2728細胞融合過程大致可分為四個階段：細胞的接觸、細胞質(zhì)膜的融合、細胞質(zhì)的重組和遺傳物質(zhì)的選擇。29二、細胞融合的意義細胞融合不受種屬的界限，可以實現(xiàn)種間生物體細胞的融合，是遠緣雜交成為可能，因而是改造細胞遺傳物質(zhì)的有力手段。2.1理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。2.2融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。302.3體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA也可以發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。2.4淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。總之，細胞融合的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限和生殖壁壘，極大地擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。細胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作。在技術(shù)和設(shè)備上沒那么復(fù)雜，有著重大的實踐意義，正得到科學(xué)界的日益重視。31三、細胞融合技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用酵母菌的育種氨基酸生產(chǎn)菌的育種酶制劑生產(chǎn)菌株的育種單克隆抗體的制備32三、動物細胞融合動物細胞融合是從細胞水平來改變動物細胞的遺傳性，用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品。培育動物新品種，縮短動物的育種過程，動物細胞融合的應(yīng)用范圍已廣及生物學(xué)的各個分支學(xué)科，可別是在繪制人類基因圖譜方面取得了顯著成就。雖然細胞雜交屬于理論生物學(xué)范疇，但是在實際應(yīng)用方面也有重大突破。在基礎(chǔ)理論研究上，動物細胞融合技術(shù)對于研究細胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機制等方面都有重要意義。在實際應(yīng)用方面，動物細胞融合技術(shù)在藥物定向釋放系統(tǒng)、細胞治療以及抗腫瘤免疫等方面起到重要的作用。33用于生產(chǎn)單克隆抗體只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能像骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)。中科院上海細胞生物學(xué)研究所研制成功抗北京鴨紅細胞和淋巴細胞表面抗原的單克隆抗體，同時還與有關(guān)醫(yī)學(xué)部門合作，成功地制備了抗人肝癌和肺癌的單克隆抗體。343536皮膚燒傷，如果創(chuàng)面很小（不大于硬幣）只要保持清潔，甚至深度燒傷，也可能自愈。如果下層真皮受損面積較大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自燒傷病人自身未燒傷的部位（自體植皮），也可取自其他活人或尸體（異體植皮）等。自體植皮是永久性的，取自其他人或動物的植皮是暫時性的，是在創(chuàng)面愈合過程中為保護創(chuàng)面而采取的措施，10～14天后就要被身體排斥。如果一個大面積燒傷的病人來說，自體皮膚有限，其他渠道的皮膚來源不足。如何才能獲得大量的自體健康皮膚？第三節(jié)動物細胞工程及其應(yīng)用37一、動物細胞培養(yǎng)

1.發(fā)展歷史:20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細胞周圍的其他細胞融合而成的。生物學(xué)家們就這個問題展開了激烈的爭論。1907年，美國生物學(xué)家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實驗不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動物組織培養(yǎng)不斷改進并逐漸發(fā)展成為動物細胞培養(yǎng)。382、動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念：動物細胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和增殖.394041動物細胞的培養(yǎng)過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)單個細胞動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)剪碎組織的目的？胰蛋白酶處理的目的？42有關(guān)概念原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。（分裝前的細胞培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。43有關(guān)概念

細胞株：傳代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。

細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。

細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。444、動物組織細胞培養(yǎng)要求（1）體外培養(yǎng)特點:

大多數(shù)動物細胞要附在物體上表面生長，動物細胞培養(yǎng)對營養(yǎng)要求更嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖外，還需要血清。對環(huán)境適應(yīng)性差，對環(huán)境敏感，包括：PH、溶解氧、溫度、剪切力等比微生物要求更高。45（2）培養(yǎng)工具:培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管、多孔培養(yǎng)板等。細胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主。器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。46根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細胞傳代培養(yǎng)的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位。

47（3）培養(yǎng)條件

細胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細胞基本相同。

【討論】多細胞動物和人體的細胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，討論以下問題：1.體外培養(yǎng)細胞時需要提供哪些物質(zhì)？提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境。2.體外培養(yǎng)的細胞需要什么樣的環(huán)境條件？提示：無菌、無毒的環(huán)境。481）恒定的溫度:37℃，維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1小時，細胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡。低溫下會使細胞代謝速率降低492）PH：7.2-7.４當(dāng)PH低于6或高于7.6時的生長會受到影響，甚至死亡。用來檢測PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。503)氣體：ＣＯ２有調(diào)節(jié)PH的作用。氣體是人體細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。

514）營養(yǎng)—培養(yǎng)基：在保證細胞滲透壓的情況下，培養(yǎng)液里的成分要滿足細胞進行代謝所需要的各種營養(yǎng)，如包括十幾種必需氨基酸及其他多種非必需氨基酸、維生素、碳水化合物及無機鹽類等。只有滿足了這些基本條件，細胞才能在體外正常存活、生長。動物細胞的培養(yǎng)基一般分為天然、合成、無血清培養(yǎng)基幾種，此外細胞培養(yǎng)還需要一些常用的溶液。52合成培養(yǎng)基

1951年厄爾開發(fā)了供動物細胞體外生長的人工合成培養(yǎng)基(MEM)。合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對實驗條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。人工合成培養(yǎng)基，如109培養(yǎng)液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培養(yǎng)液等。53天然培養(yǎng)基直接采用取自動物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分。它含有許多維持細胞生長繁殖和保持細胞生物學(xué)性狀不可缺少的未知成分。

使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細胞快速增殖生長。54常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清分為胎牛血清和犢牛血清，前者來源少，價格高；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因為哺乳后的小牛血清中可能含有更復(fù)雜的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。55氨基酸是細胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有8種是細胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供。激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長因子(IGFl、IGF2)等。

水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成0．5％溶液，微酸性。膠原是從動物真皮中提取的，具改善細胞表面特性促使其附著生長的作用。56無血清培養(yǎng)基動物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對細胞生長很有效，但后期對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。無血清培養(yǎng)基不加動物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細胞生長有效因子，激素等。575)細胞培養(yǎng)溶液平衡鹽水（BSS）：

Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎(chǔ)溶液。PH調(diào)整液：

NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸）細胞消化液:

胰蛋白酶溶液．EDTA溶液．膠原酶溶液58抗生素溶液：1)青、鏈霉素:每毫升培養(yǎng)液含100U青霉素和100ug鏈霉素.2)卡那霉素：終濃度為50ug/ml培養(yǎng)液。3）制霉菌素：濃度25U/ml，小瓶分裝，每瓶一次用完。596)、無污染環(huán)境

培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細胞生存的首