電鏡技術及超薄切片技術-課件

電鏡技術及超薄切片技術

電鏡室現(xiàn)有設備1、H-7500型透射電鏡,購于2004年,最大點分辨率為0、24nm,有效放大倍數(shù)達60萬倍。2、S-3000N型掃描電鏡,購于2004年,有效放大倍數(shù)達30萬倍。3、輔助設備:Tome-PowerXL超薄切片機,零界點干燥儀,離子濺射儀等。

1924年,法國Broglie提出了“電磁波與光一樣,具有波動性“的假說,并計算出電磁波長為0、005nm、1926年,德國科學家Busch發(fā)現(xiàn)了帶電粒子在電場或磁場中偏轉聚焦的現(xiàn)象。1928—1931年間,德國的Ruska成功研制了世界上第一臺真正的電子顯微鏡,放大倍數(shù)為1200倍。20世紀50年代初到60年代末期,電鏡分辨本領得到大幅度提高,達到1nm左右,到80年代的點分辨率已接近0、1nm,最新研制的超高壓透射電鏡(1000KV)的點分辨率可高達0、001nm。

電鏡基本類型一、透射式電子顯微鏡二、掃描式電子顯微鏡三、依照電子槍發(fā)射方式不同,可分為熱陰極電子槍和場發(fā)射電子槍。四、其他

(冷凍或低溫電子顯微鏡、高壓或超高壓電子顯微鏡、分析電鏡、掃描隧道顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、掃描光子顯微鏡、原子力顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡等約幾十種不同類型電鏡)舉例說明:清華大學生命科學學院院長施一公帶領的研究團隊在《科學》在線發(fā)表了兩篇研究長文,揭示了剪接體結構及其工作機理。舉例來說,一個蘋果,它本身是三維的,我們拿二維照相機多方位、多角度地拍特別多張照片,就能重構出蘋果的三維模型。(三位重構技術)事實上冷凍電鏡就相當于一個照相機,當選好的冷凍樣品被送到冷凍電鏡時,會生成特別多圖像,這些圖像組合起來便能夠構建一個三維結構。當數(shù)據收集系統(tǒng)收集到大量剪接體的圖像后,就能夠重構一個剪接體的三維結構?，F(xiàn)在科學研究中,科研儀器扮演者越來越重要的角色,這些儀器依托于科學家研發(fā)的技術,是科學家眼睛、手和腦的延伸。由于生理結構,人類的一些功能會有局限性,實驗必須借助儀器來完成。主要內容1、電鏡的基本原理和結構簡介(了解)2、電鏡的樣品制備(透射電鏡和掃描電鏡)(重點在于取材方面)3、電鏡的應用簡介(熟悉)

光學顯微鏡與電子顯微鏡在工作原理上的比較:

光學顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對光進行折射,將一物點發(fā)出不同角度的光線最終會聚成一個像點。

電子顯微鏡是利用電場或磁場(電磁透鏡)折射高速電子束流,達到成像目的。

光源聚光鏡樣品物鏡投影鏡最終象透射電子顯微鏡光學顯微鏡

透射電子顯微鏡的原理和結構

光的衍射現(xiàn)象:

由于光具有波動性,當光線通過小孔或小孔光源經光學系統(tǒng)成象會產生衍射。其圖案是:中央部分一個亮斑,在其周圍有明暗交替的圓環(huán)。2D顯微鏡的分辨本領顯微鏡分辯本領是由其產生的衍射圖中央亮斑半徑D(分辨能力)大小來決定的即

D=

當光的波長為λ=500nm=0、5μm

介質折射率(油)=1、5

物體與物鏡所形成夾角的半數(shù)α<90o

央亮斑的半徑D=200nm

=0、2μm

1、人眼在明視距離250mm處能分辨0、2mm的兩點。

油鏡最小能分辨0、2μm的兩點。

則油鏡理論最大放大能力為:

0、2mm/0、2μm=1000(倍)2、假如一臺電鏡的點分辨率為0、1nm,則其理論放大倍數(shù)為:0、2mm/0、1nm=2x1063、H-7500型透射電鏡的點分辨率為0、24nm,則其理論放大倍數(shù)為:0、2mm/0、24nm=0、83x106。而其有效放大倍數(shù)為0、6x106

光線通過二個比較靠近的小孔時,這二個小孔的衍射圖會重疊在一起。當一個衍射圖的中央亮斑正好落在另一個衍射圖的第一暗環(huán)中心時,這二個點剛能夠分辯。這就是顯微鏡分辯本領的瑞利準則。瑞利準則:什么是電磁透鏡？由于軸對稱彎曲磁場對電子束有聚焦作用,因而能夠得到電子光學像。我們稱這種具有軸對稱彎曲磁場裝置構成的電子透鏡為電磁透鏡(electronmagneticlenses)。由于電磁透鏡磁場非均勻分布,物、像點在磁場之外,電子在磁場中既受到軸向分量的作用,又受到徑向分量的作用,使平行于軸進入磁場的電子束可獲得聚焦。電磁波長的計算

依照公式λ=(nm)

如V=50000v

則λ=0、005nm=0、000005μm

代入公式D=則D=0、000002μm電鏡的像差和畸變①球差:電子束光源通過透鏡受到偏轉,通過樣品,從物平面向下發(fā)射,形成物點孔徑角。從物點發(fā)出的射線,到達下一級透鏡又被聚集。假如透鏡有缺陷或孔徑角太大,則靠近光軸的射線和遠離光軸的射線,受到電磁場的作用就會不同,這些射線在光軸上會聚的位置不同,結果遠離光軸的射線就會在像面上形成一個最小模糊圈。此時可有圖象中央凸起感。這是目前影響電鏡分辨率的一個主要因素。②像散:由于透鏡的磁場強度在縱向或橫向上不同,以致縱向與橫向上的射線聚焦于光軸的位置也有上有下,兩者共同形成一個最小模糊像。③色差:由于電磁波長隨加速電壓而變化,當加速電壓不穩(wěn)定時,電子束波長就可變異,因而發(fā)生類似的像差。

④畸變:由于離軸較遠處的徑向磁場的作用力強,使放大倍數(shù)隨物點離軸的距離而變化,進而使圖象發(fā)生改變而產生的?；兂Ｒ姷挠姓硇位?、桶形畸變和S形畸變等,如圖所示:反差人的眼睛在區(qū)分物體時,主要依照物體不同部位或物體之間的光強度與波長的差別,這些差別構成了物體的反襯度,又稱為“反差”。電鏡與光鏡一樣也存在反差現(xiàn)象。由于電鏡標本上的不同部位的物質結構不同,疏密度不同,它們散射電子的能力也各不相同,散射電子能力強的地方,顯現(xiàn)為暗像;相反,散射能力弱的地方,顯現(xiàn)為亮像。因此,在熒光屏上所看到的是由暗像與亮像組成的具有一定反差的熒光圖像。1、照明系統(tǒng):

電子槍:可分為熱陰極和場發(fā)射兩種。前者主要有鎢絲(W)和六硼化鑭(LaB6);后者又分熱場發(fā)射和冷場發(fā)射,一般采納的是單晶鎢,但現(xiàn)在有采納六硼化鑭(LaB6)的趨勢。聚光鏡2)樣品室3)成象系統(tǒng):物鏡中間鏡投影鏡4)觀察記錄系統(tǒng):觀察室照相機CCD數(shù)字成像系統(tǒng)5)輔助系統(tǒng)透射與掃描電鏡原理圖解掃描電子顯微鏡工作原理及結構通過極細的電子束掃描射擊標本表面而激發(fā)出二次電子或產生反射電子,并通過一定途徑被接收到陰極射線管而成像。掃描電鏡由兩個主要部分組成:探查系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)一、探查系統(tǒng):由電子槍、電磁透鏡組成。

二、顯示系統(tǒng):電子檢測器,閃爍器,光電倍增器以及顯示屏組成。

電子束的穿透能力一般較弱,大多數(shù)標本無法直截了當在電鏡下觀察,必須把樣品切成厚度為10—1000nm的薄片。我們把切片厚度小于100nm的薄片稱為超薄切片,是電鏡觀察生物樣品常用方法之一,常用厚度為50-100nm。(1)

超薄切片技術二、透射電子顯微鏡樣品制備透射電鏡樣品制備(包埋塊制作)操作流程:

取材——漂洗(生理鹽水)——前固定(2、5%戊二醛,4oC冰箱2小時以上)——漂洗(0、1M磷酸緩沖液,3次,45分鐘)——后固定(1%鋨酸1小時左右)——漂洗(0、1M磷酸緩沖液,3次,45分鐘)——塊染(1%醋酸鈾2小時)——梯度脫水(50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分鐘,100%2次,各10分鐘)——浸透(丙酮:包埋液=1:1,37oC烘箱2小時;丙酮:包埋液=1:4,37oC烘箱過夜;純包埋液45oC烘箱2小時)——包埋聚合(45oC烘箱3小時,65oC烘箱48小時)透射電鏡樣品制作示意圖

取材要點及注意事項快:取材時間在1—2分鐘以內完成;小:體積大小在1立方毫米左右或橫切面為1平方毫米的長條形;

冷:固定液溫度在4攝氏度左右。準:取材部位要準確,盡量取材于所要觀察的部位。取材方法介紹:

1、器官組織取材法:主要針對活體器官組織的取材如腎、肝、肺等活檢組織2、游離細胞收集法:主要針對培養(yǎng)細胞及游離細胞如血細胞、脫落細胞等。常用方法有血漿或血清預包埋法。標本取材方向及大小示意圖雙刀切割法常見臟器的取材簡介１、灌注固定

2、注射固定3、浸泡固定

4、位置選擇:要觀察生精細胞或支持細胞,取材于睪丸的睪丸網部位,大鼠與小鼠的睪丸網比較表淺,就在白膜下附近。假如要觀察成熟精子,最好取材于附睪的尾部,此處精子已基本成熟,而且精子密度最高。睪丸組織取材方法肝組織取材法1、灌注固定法2、浸泡固定法動物經麻醉后打開腹腔,暴露出肝臟,選取一片肝小葉(如左小葉),先用細線扎緊小葉間連接部位防止出血,接著用手術剪剪下這片小葉組織放在滴有固定液的蠟板上進行修塊,切成1立方毫米大小即可。1、腦組織灌注固定(4%多聚甲醛溶液)２、取材位置選擇:如研究腦神經軸索、髓鞘以及神經膠質細胞,建議取材于腦組織白質部分,此處有髓神經纖維相對較多,膠質細胞比較豐富;如要研究神經元以及血腦屏障結構,建議取材于腦皮質的灰質部分。３、定向包埋,以神經元長軸方向(大約為腦組織的矢狀面)作為切面方向,如此能夠特別好地觀察神經元細胞核、軸突以及樹突結構的變化,突觸以及毛細血管的結構也比較容易見到。

１、灌注固定2、浸泡固定:載玻片擠壓法:將組織放在載玻片上,并將固定液滴在其上,用另外一片載玻片輕輕壓在上面并輕輕擠壓。

3、位置選擇:假如以研究支氣管粘膜或研究肺動脈為主的(這個地方指肺內的支氣管),盡量取材于靠近肺門部位。假如主要研究肺泡上皮細胞、終末細支氣管、呼吸性細支氣管以及肺泡隔的結構等,建議取材于肺葉靠近胸膜一側或者肺尖部。肺組織取材法１、灌注固定或浸泡固定(主要是腎穿刺活檢)２、位置選擇:依照需要切取皮質或髓質進行觀察。動物腎組織取材要注意的是,一要取材位置選擇在腎的上極,二要準確判定皮質與髓質的位置,假如是皮質部位,只要將包膜分離后,將腎最外層組織取下來即可,這個地方一般都會有腎小球存在。一般要求切長條形。腎組織取材法

胃腸道取材法

剖開胃腸道腔,暴露出粘膜面,用PBS或生理鹽水浸洗內腔,盡量清洗干凈,但注意保護好粘膜面以免損傷,然后剪一段組織進行修塊。具體做法如下:沿著胃腸道縱軸和橫軸各切幾條長約2毫米,寬約1毫米的長條形組織,盡量包括粘膜全層結構,以直截了當浸泡固定方法為宜,注意保護粘膜層細胞免受人為損傷。各實驗組選取部位盡量在相同部位,以利實驗比較。骨組織取材方法取小塊骨片(1～2mm大小),先用2、5%戊二醛固定2小時,磷酸緩沖液漂洗2次,再將骨片浸入脫鈣液進行脫鈣處理,視脫鈣效果而定脫鈣時間,如用EDTA脫鈣液,大約3天時間,主要視組織塊是否變得柔軟,通常用細針刺脫鈣骨片是否容易刺穿來判斷脫鈣效果。軟骨組織一般直截了當固定,不需要脫鈣處理。皮膚組織取材方法皮膚組織一般觀察表皮細胞及部分固有層結構,取材以長條形為主,長約1、5mm,橫徑在0、5mm-1、0mm,包括表皮全層細胞及部分固有層(依據上文定向取材圖示處理),表皮是復層鱗狀上皮層,無血管分布。真皮部分位于表皮深面,主要由膠原纖維和彈性纖維交織構成,并含有從表皮陷入的毛發(fā)和腺體,以及從深層來的血管、淋巴管、神經及其末梢,一般不需要定向取材,但要注意位置的準確。外周神經纖維的取材方法脊椎動物的外周神經系統(tǒng)包括由腦發(fā)出的腦神經和由脊髓按節(jié)段性排列發(fā)出的脊神經。按所聯(lián)系的器官不同,可分為軀體和內臟兩大類,每一類又可依照傳導興奮的方向不同而分為傳入神經和傳出神經兩類。取神經纖維時,應先分離掉包裹神經的神經外衣,再分離出所要研究的神經。假如神經纖維直徑在1mm以內,可直截了當切成1、5mm長條形即可,假如直徑較大,則一分為二,同樣切成長條形。需要注意的是,在包埋的時候必須定向包埋,縱橫方向都要包埋。肌肉的取材方法每塊肌肉都是具有一定形態(tài)、結構和功能的器官,有豐富的血管、淋巴管分布,在軀體神經支配下收縮或舒張,進行隨意運動。肌肉具有一定的彈性,當外界刺激較激烈的情況下,肌肉往往出現(xiàn)痙攣現(xiàn)象,因此,切取肌肉組織后應先浸泡在生理鹽水或磷酸緩沖液中,等肌肉恢復自然常態(tài)后再取材,縱橫方向都要取,以長條形為主,大小約1*1*1立方毫米,然后浸入固定液內進行固定,需要注意的是,在取心肌的時候應取在心尖部位,在包埋的時候必須定向包埋。胰腺的取材方法胰腺可分為胰頭、胰體和胰尾三部分。胰腺一般觀察胰島細胞、腺泡細胞以及導管細胞,胰島主要分布在胰尾部位,胰體部位較少,腺泡及導管基本存在于胰體內,容易觀察。組織能夠直截了當浸入固定液內固定。值得注意的是,由于胰腺腺泡內酶原顆粒較豐富,容易引起細胞自溶,取材時要盡量快速取材以免細胞自溶影響結果。腫瘤組織取材方法腫瘤的生長位置幾乎遍布全身,腫瘤組織主要觀察腫瘤細胞的組織來源、細胞類型、分化程度以及與周圍組織的關系等內容。電鏡標本的取材應多位置取材,包括腫瘤的實體內部、生長發(fā)生部位、與周圍正常組織的交界部位以及癌旁組織。各部位均要取若干個組織塊進行固定,如此才能觀察的比較全面,尤其懷疑是惡性腫瘤的組織。大小約1mm*1mm*1mm,不能過大。游離細胞取材法血漿凝集法:將抗凝全血離心分層(2000轉/每分鐘,10—20分鐘),用毛細吸管沿著管壁輕輕的將上清夜吸取(不要破壞白細胞層),接著用吸管吸取固定液,并沿著管壁將2、5%戊二醛固定液慢慢地加入進行固定,然后把它放在4℃冰箱內保存。血漿(血清)混合法:如為細菌、病毒、脫落細胞、培養(yǎng)細胞則先將它們制成懸液放置于離心管內(最好是玻璃的),離心成團(1000～3000轉/分鐘,10分鐘,下同),去上清液后加入2、5%戊二醛固定10分鐘左右,離心,再棄去多余的固定液,然后和少量抗凝血漿或血清混合均勻,離心成團,去上清液(留少許),用吸管吸取2、5%戊二醛固定液沿著離心管壁緩慢滴入,盡量幸免團塊分散,靜置于4℃冰箱內保存?zhèn)溆?。雙重固定法:

1、固定目的是盡量保持細胞生活時的形態(tài)結構以及減少細胞的死后變化。

2、前固定一般采納2、5%戊二醛溶液固定,后固定采納1%鋨酸溶液固定

3、常用固定劑:2、5%戊二醛、1%鋨酸、

4%多聚甲醛溶液、福爾馬林、高錳酸鉀等,有時還用戊二醛-多聚甲醛混合固定液固定。固定不良,染色淡,結構不清楚固定較好,染色較深1、組織塊固定:切割小塊浸入固定液中的方式。2、游離細胞的固定:有離心法和懸浮制備法。3、原位固定法:結扎相應血管,在臟器表面切割“井”字型,然后直截了當在該表面上滴加固定液進行固定。4、灌注固定法:目前比較廣泛采納,效果較好。幾種化學固定方式:漂洗

目的是完全洗凈戊二醛固定液的殘余,防止其與鋨酸起化學反應而降低固定效果。常用漂洗液為0、1M的磷酸緩沖液(PBS)和二甲砷酸鈉緩沖液(注意有毒性)。塊染

就是對組織塊進行1%醋酸雙氧鈾整塊染色。時間為1—2小時。脫水(酒精或丙酮)梯度脫水:70%丙酮15分鐘,80%丙酮15分鐘,90%丙酮15分鐘,100%丙酮１0分鐘(二次)。關鍵在于純丙酮脫水！

浸泡與包埋浸泡:使某種適宜的液體介質(包埋劑)滲入組織塊取代脫水劑。包埋:使浸入的介質(環(huán)氧樹脂包埋劑)經高溫處理后聚合為固體,將組織塊包埋其中,利于超薄切片。常用包埋劑:Epon-812環(huán)氧樹脂、DDSA、MNA以及加速劑DMP-30等。特別注意:操作過程中要嚴防包埋劑吸潮!

包埋劑的理想性質理想的包埋劑應具有以下性質:(1)、粘度低,容易滲入組織;(2)、聚合均勻而充分,聚合前后體積變化小;(3)、有良好的切割性能;(4)、能耐受電子束轟擊,高溫下不變形;(5)、對細胞成分抽提少,微細結構保存良好;(6)、在電鏡的高倍放大下,本身不顯示任何結構;(7)、材料來源豐富、易得,價格低廉,對人體無害。超微病理標本微波快速制備流程:(了解)取材(按常規(guī)要求方法)——3%戊二醛固定后經微波高火照射20秒,室溫接著固定20分鐘——1%磷酸緩沖液漂洗4次,每次5分鐘,微波中火照射20秒——1%鋨酸微波中火照射10秒,室溫接著固定20分鐘——丙酮50%、70%、80%、90%脫水,微波中火照射20秒,室溫接著脫水2分鐘。100%丙酮脫水3次,每次微波中火照射20秒,室溫3分鐘——丙酮:包埋劑=1:1浸透,微波中火照射20秒,室溫接著浸透5分鐘——丙酮:包埋劑=1:3浸透,微波中火照射20秒,室溫接著浸透5分鐘,2次——純包埋劑微波中火照射20秒,室溫10分鐘——常規(guī)包埋——聚合:70℃20分鐘,95℃30分鐘,110℃60分鐘——半薄切片光鏡定位——超薄切片——醋酸鈾微波中火照射染色30秒,雙蒸餾水漂洗——枸櫞酸鉛微波中火照射染色20秒,雙蒸餾水漂洗——45℃烘箱干燥——電鏡觀察。注意:高火:600——800W;中火:約400W。超薄切片流程

1、切片前的準備:銅網清洗(用丙酮和乙醇浸洗)

2、支持膜制備:常用Formvar膜(聚乙烯醇縮甲醛)由氯仿配置,濃度為0、5%。

3、玻璃刀制備:專用制刀機制作。

4、半薄切片光鏡定位(需要了解組織細胞結構)。5、超薄切片:專用超薄切片機切片,需要培訓。厚度在50—100nm之間較為合適。6、染色:檸檬酸鉛-醋酸鈾雙重染色法。假如前面差不多進行塊染的,只要鉛染即可。電鏡觀察、拍片、記錄等首先,觀察人員要熟悉電鏡的基本操作程序以及所要觀察材料的相關知識。熟悉CCD數(shù)字成像系統(tǒng)的基本操作程序。其次,做好觀察記錄,選好范圍拍片,準確記錄底片號碼及相應內容。。最后,做好各種資料的整理、備案工作。取材(做好樣品觀察面的標志)——漂洗(生理鹽水或緩沖液)——固定(2、5%戊二醛2小時以上)——漂洗(0、1M磷酸緩沖液,3次,45分鐘)——后固定(1%鋨酸,2小時)——脫水(50%、70%、80%、90%、95%各15分鐘,換醋酸異戊酯15分鐘或叔丁醇15分鐘)——干燥(零界點干燥或冷凍干燥)——鍍膜(真空鍍膜儀或離子濺射儀)掃描電鏡樣品制備流程

負染技術

觀察顆粒狀生物材料的外部形狀常用的染色方法。用重金屬鹽沉積到樣品四周,樣品四周散射電子的能力就較強,因而表現(xiàn)為暗區(qū);樣品本身散射電子的能力較弱,則表現(xiàn)為亮區(qū),如此便能把樣品的外形與表面結構清楚地襯托出來。常用磷鎢酸鹽或醋酸鈾溶液。電鏡酶細胞化學技術電鏡酶細胞化學技術是在光鏡細胞化學的基礎上發(fā)展起來的新的一門技術。酶存在的特定位置稱為酶的定位。主要通過酶的活性作用結果間接地證明酶的存在。目前能在電鏡下定位的酶有三大類即水解酶、氧化酶和轉移酶,有100多種。注意:在整個處理過程中必須保存酶的活性不受破壞。以下以氧化還原酶(可分為氧化酶和脫氫酶兩種)為例進行說明。

在氧化酶細胞化學反應中含有兩個既分開又緊密聯(lián)系的底物,一個是生理底物如氧或過氧化氫;另一個是捕捉底物,通常是四鹽酸3,3‘二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。DAB特別容易氧化,經過一系列化學變化生成強嗜鋨性的聚合物,再經鋨酸固定就形成鋨黑。

脫氫酶常用的捕捉劑為鐵氰化物,它在酶的作用下被還原為亞鐵氰化物,在銅離子的存在下進一步形成高度不溶性的亞鐵氰化銅沉淀。酶細胞化學的常規(guī)操作流程1、固定:常規(guī)固定液選取2、5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作為固定液,常用的緩沖液有二甲砷酸鈉緩沖液及Tris緩沖液等。2、切片:一般采納組織切片機進行切片,厚度在40～60μm,也能夠用冰凍切片機切片。3、漂洗:用配置孵育液的緩沖液進行漂洗3次,每次10分鐘。4、孵育:孵育時必須在使用前配置新鮮孵育液。將切片放入孵育液內,在震蕩式恒溫水浴箱中孵育,孵育溫度一般為37℃。5、漂洗:用配置孵育液的緩沖液進行漂洗3次,每次10分鐘,然后用

0、1M二甲砷酸鈉緩沖液漂洗3次,每次10分鐘,所用緩沖液要保持在4℃左右。6、后固定:用0、1M二甲砷酸鈉緩沖液配置的1%鋨酸固定1小時。脫水、浸透、包埋、切片同常規(guī)超薄切片制作。7、電鏡觀察:超薄切片經烘干后直截了當進行電鏡觀察。假如反差不行,能夠進行鉛—鈾雙重染色,但必須有不染色的切片對比。免疫電鏡膠體金標記技術免疫電鏡膠體金標記技術也稱金標法(或免疫金染色)。金標法是利用膠體金(Colloidalgold)在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質,使其與抗體相吸引,從而將抗體標記。電鏡下金顆粒密度特別高,清楚可辨。膠體金是金的水溶膠,主要用還原法制備。較多用的還原劑有枸櫞酸鈉、白磷、鞣酸、乙醇、抗壞血酸、過氧化氫等。枸櫞酸三鈉還原法1)取0、01%氯化金(HAuCl4或AuCl3HCl溶液)100ml,放入潔凈錐形瓶內煮沸。2)取1%枸櫞酸三鈉水溶液4ml,加入煮沸的氯化金中。3)混合、攪拌、煮沸,約5分鐘,溶液顏色由藍→紫→橙紅,冷卻后即可。此時膠體金顆粒直徑約為15nm。如將枸櫞酸三鈉的量分別減少至1、5ml、1、0ml、0、75ml,則膠體金顆粒直徑將分別增至30、50或60nm、膠體金標記物(金探針)的制備1、膠體金標記蛋白質及其純化

1)取100ml膠體金PH為7、2。

2)稱取相應最適量蛋白質,于去離子水中溶解(100ul)。

3)在磁力攪拌器中將上述兩液混合、靜置。

4)10分鐘后再加入膠體金穩(wěn)定劑,如3%聚乙二醇(PEG)或5%

小牛血清白蛋白(BSA)。

5)用超速離心法去除未標記蛋白質。離心速度和時間取決于金顆粒大小及蛋白質的種類。膠體金標記羊抗兔IgG,以牛血清白蛋白穩(wěn)定者,先用低速離心20分鐘(金顆粒20nm者用250轉/分,5

nm者用4000轉/分,視金顆粒實際大小情況而定離心速度)。留取上清液,再以高速離心,4℃下離心1小時(金顆粒20nm者用14000轉/分,5nm者用60000轉/分,視金顆粒實際大小情況而定離心速度)。棄上清液,留取沉淀物備用。

6)將沉淀物用0、02MPBS(pH8、2,內含1%BSA或PEG)懸浮、清凈,高速離心,重復三次,最后將膠體金標記物溶于原液體積1/10的TBS中,即可應用。免疫金染色法,可分為

包埋前染色和包埋后染色。

包埋前染色對細胞膜的穿透性差,

一般只用于細胞表面抗原的標記。

因此,現(xiàn)今普遍采納包埋后染色。電鏡包埋后膠體金染色法1)超薄切片80nm左右置于無支持膜的鎳網上。2)至1～10%H2O2液中處理10分鐘～1小時不等,越硬需要H2O2濃度越高越利于抗體進入。3)雙蒸餾水洗3次,每次5～10分鐘。4)浮于正常羊血清(1:50～1:100)液滴上,室溫30～60分鐘,或1:5,5分鐘。5)PBS漂洗3分鐘,PBS(內含1%牛血清白蛋白)PH8、2中,5分鐘。6)加適量稀釋的膠體金標記抗體液(1:30～1:100),淡紅色為適宜稀釋液,4℃20小時或室溫10分鐘～2小時。7)雙蒸餾水洗3次,每次3分鐘。8)如做雙重染色,則應將鎳網翻過來,用另一類抗體血清,重復2～7步驟。9)5%醋酸鈾染色,5分鐘,雙蒸餾水洗滌,3次。10)枸櫞酸鉛染色,5分鐘,雙蒸餾水充分洗滌。11)干燥后電鏡觀察。結果:陽性抗原部位聚集金顆粒。標本回顧性研究——

石蠟塊做超薄切片技術1、定位取材:依照光鏡顯示,切取需要的部位,大小約1mm3

的若干小塊。2、溶蠟:先在37℃烘箱內熔蠟4小時,再二甲苯37℃烘箱內

浸泡8—12h,期間要震蕩搖換一次。3、水化:用100%(1小時)、90%、80%、70%丙酮進行水化(各15分鐘),直到完全水化。4、漂洗:用緩沖液漂洗(0、1M磷酸緩沖液或二甲砷酸鈉緩沖液)兩次,各15分鐘。5、固定:用2、5%戊二醛固定2小時以上,其余步驟同常規(guī)電鏡樣品制作處理。1、生命科學上的應用:幾乎包括所有的學科研究領域都差不多用到或馬上用到電鏡技術。比如動物或植物細胞的超微結構(包括細胞核、細胞質及其細胞器等內容物、細胞間的連接等)的形態(tài)觀察,通過對比觀察,對動植物形態(tài)在超微結構水平上進行分類、分型,以探討遺傳、變異及病理病因的機理或機制,為生命科學的基礎研究所不可或缺的研究手段。利用常規(guī)電鏡技術和特別電鏡技術如免疫電鏡技術、電鏡酶細胞化學技術、電鏡原位雜交技術等能夠進行細胞細胞超微結構及超微病理分析,以及細胞內抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。電鏡應用簡介2、在臨床診斷中的應用:主要應用于臨床活檢組織的超薄切片觀察分析。通過活檢組織的細胞形態(tài)變化及其相互間的關系,依照其形態(tài)變化規(guī)律和特點進行分析診斷,為臨床病理診斷或輔助診斷提供較可靠的形態(tài)依據。在鑒別腫瘤組織來源、分化程度、浸潤情況等,以及疾病的病理分型或分期和疾病的早期病理改變等方面,電鏡比光鏡具有一定的優(yōu)勢。病原微生物(如細菌、病毒、支原體、囊蟲等)的形態(tài)觀察或鑒別也是電鏡觀察的強項。3、材料上的應用:包括材料的內、外部結構或形貌觀察,顆粒形態(tài)、大小測量、排列分布等情況。假如應用能譜分析儀器,就能夠檢測材料的元素組成、含量、分布等情況。4、其他領域上的研究:如礦物質、考古等。如何拍攝電鏡照片電鏡拍攝既是一門技術,又是一門藝術。先低倍,后高倍;先大體,后局部;先對比,后模型,再療效。電鏡應用及超微結構支原體絨毛內支原體細菌卡氏肺囊蟲隱球菌－可見莢膜肺內大腸桿菌感染艾滋病病毒艾滋病病毒ＳＡＲＳ病毒乙型肝炎病毒核仁細胞核質膜內褶線粒體溶酶體卵細胞示意圖透明帶卵黃顆粒人類卵細胞局部結構精子鞭毛橫斷面９＋２系統(tǒng)小鼠精子結構線粒體鞘石璜精子結構泥螺精子細胞尾部結構細胞核核固縮突觸結構中心體神經元細胞心肌細胞線粒體固縮胃腺癌細胞肝轉移肌絲溶解現(xiàn)象RER版層狀排列骨骼肌糖原沉積Cap血腦屏障內皮細胞內彈力板脫髓鞘現(xiàn)象細胞質溶解弓形蟲感染細胞肝細胞淋巴細胞隱窩細胞病毒顆粒ＲＥＲ電子致密物細胞水腫細菌菌毛細胞壁肝細胞糖原沉積粗面內質網白血病淋巴細胞膠體金顆粒巨噬細胞吞食現(xiàn)象納米碳管足細胞及足突結構近曲小管上皮細胞線粒體結構－縱切近曲小管上皮細胞微絨毛足細胞足突溶酶體線粒體微絨毛(刷狀緣)果蠅果蠅復眼米象金屬出芽觸角頭發(fā)晶體粘膜表面化纖細菌培養(yǎng)細胞細菌腫瘤細胞人造纖維人造血管微球電鏡技術練習題1、透射電鏡標本取材的基本要求并簡要說明。2、什么是瑞利準則？電鏡與光鏡在原理上有何相似和不同之處？3、簡述透射電鏡及掃描電鏡樣品制作流程4、常用的化學固定方法有哪些？5、普