已知基因序列的獲取方法教學(xué)課件

口知基因序列的獲取策略兼談引物設(shè)計(jì)與序列分析黃鋼第三軍醫(yī)大學(xué)遺傳教研室2019.111獲取序列信息,設(shè)計(jì)合適的引物選取相應(yīng)的組織或細(xì)胞,提取RNA并RTRNaseh消化(可選)PCR擴(kuò)增獲得全長CDNA裝入合適的克隆或表達(dá)載體,菌落PCR、酶切與測序證實(shí)根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行亞克隆、如何獲取已知目的基因的序列信息■先査找其蛋白相關(guān)信息,了解該基因編碼產(chǎn)物的基本情況與功能()進(jìn)一步查找其核酸相關(guān)序列信息,常用數(shù)據(jù)庫:Genebank、EBI、DDBT)解軟)工D帶助的SeadExPASyContactsEXPASyProteomicsServerTheEXPASy(ExpertProteinAnalysisSystem)proteomicssemeroftheSwissinsituteoBonformanics(SB)isdedicatedtothearalysiscfproeinsequences4cm時(shí)!b0peningMinotdanbfcadipnandchalacisnzdion(Aldente,Findkod,Ptpilam,Phang,plow.SWISS-MODELRepository-AutomaticalygereratedproteinmodeDNA?+saChs(BLAST.]Linkst'thermolecuarbooddatabasesImageMaster/Melanie-Sofwarefor2-DPAG-analysght-MassSPectrometryImaSwissShop.automatcallyobtain(oyemail,newseqenceenniesrelevanbulletinsSwiss-ProtdocumentsCross-referencesBI83077:AAA58390.1EMBL/GenBank/DDBSequence83072,A58390.1;JIME![EELM83073,AAA58390.1:JOINE!.[EMBLGenBank/DDBI]CoDingSequerM83074oDingsequenceBC042665:AAH42665.1enBank/DDbIR1DR9:10-JAN-01.LExPASyRCSB/EBI118L:04-APR-01.ExPASy/RCSB/EBI]etailedlistoflinkedstructurCD80HGNC:1700:CD8dsCDsoenelynxCD80:Homosapiens.MIM12203[BI!EI]、目的基因CDNA序列的獲取方法CDNA文庫掃描RT-PCR人工合成組織RNA的提取在勻漿器中加工冷凍的組織通過注射器加工冷凍的組織在液氮中將組織研磨成粉末在液氮中研磨組織至粉末狀,細(xì)胞裂解更完全,產(chǎn)量比前二者多一倍合適的RNA提取方法加上合適的組織處理方法,才能夠獲得最佳的提取效果RNA提取兩要素■忌諱貪多:不能指望1mltrizol提取100mg以上組織,一般50mg用1mITrizol較合適■速戰(zhàn)速?zèng)Q:盡量縮短提取時(shí)間,不要完全照搬Protoco,比如勻漿后如果沒有很多組織碎片的話,可以立即加入氯仿,立即離心,140000m離心10min,取完上清加入0.6~1體積的異丙醇,立即高速離心(14,000rpm,5min),……總之盡量快速!盡量減少RNAase污染■RNase的危害主要集中在將RNApellet溶解在水中之后,防止RNA降解的重點(diǎn)應(yīng)當(dāng)放在組織樣本的保存和RNA水溶液的保存上?！鲎⒁鈱?shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作:各種器材的去RNAase處理與無RNAase的準(zhǔn)備。長期保存RNA