豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)培訓(xùn)課件

豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)光合作用與生物固氮是自然給予人類的兩大貢獻(xiàn)，它們分別提供了植物生長的碳源和氮源，從而提供了人類社會(huì)發(fā)展的最基礎(chǔ)的物質(zhì)條件，是農(nóng)業(yè)生物學(xué)最基礎(chǔ)的研究課題。生物固氮是指由固氮微生物將氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨的過程。1995年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）粗略估計(jì)，全球每年由生物固定的氮量近2×106t，約占全球植物需氮量的3/4。2豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)1無機(jī)態(tài)氮，即銨態(tài)氮（NH4+）和硝態(tài)氮（NO3-）。2有機(jī)態(tài)氮，如尿素等。這些氮素的來源？植物所能利用的氮素3豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)1生物固氮（占90％）2工業(yè)固氮（生產(chǎn)氮素化肥）3高能固氮（閃電）大氣中的氮?dú)饪赏ㄟ^下面途徑被“固定”4豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)自然界氮素循環(huán)工業(yè)固氮高能固氮生物固氮有機(jī)氮合成及轉(zhuǎn)化氨化作用硝化作用反硝化作用O2不足硝化細(xì)菌反硝化細(xì)菌亞硝酸鹽5豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)生物體有機(jī)酸NO3-NH4+NO2-NON2O大氣N2同化作用氨化作用硝化作用硝化作用反硝化作用生物固氮同化作用還原作用氮循環(huán)6豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)生物固氮

（固氮微生物）1共生固氮如根瘤菌與豆科植物；

2聯(lián)合固氮如放線菌與非豆科植物。

3自生固氮如圓褐固氮菌（好氧）；梭菌（厭氧）。7豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)共生固氮自然界有豆科植物19700種，其中已知可以結(jié)瘤固氮的有2800種，占15％，而對(duì)其共生固氮體系進(jìn)行過研究的只占0.5％。8豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)豆類植物根瘤形成的主要過程一豆類植物根分泌黃酮類物質(zhì)二根瘤菌分泌結(jié)瘤因子三豆類植物與根瘤菌的相互識(shí)別四豆類植物對(duì)根瘤菌的反應(yīng)五根瘤發(fā)育六根瘤成熟并開始固氮9豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)豆類植物根瘤形成的主要過程圖解根毛根瘤菌侵入線已侵入的根瘤菌根瘤10豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)一豆類植物根分泌黃酮類物質(zhì)1促進(jìn)根瘤菌生長2對(duì)根瘤菌的趨化作用3對(duì)根瘤菌結(jié)瘤基因的誘導(dǎo)4在根瘤發(fā)育與固氮中的作用5環(huán)境因素對(duì)黃酮類物質(zhì)分泌的影響11豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)常見豆類誘導(dǎo)結(jié)瘤的黃酮類物質(zhì)豆類植物根瘤菌黃酮類誘導(dǎo)劑大豆慢生菌大豆黃素金雀異黃酮快生菌傘形酮三葉草三葉草根瘤菌4,7′-二羥基黃酮苜蓿苜蓿根瘤菌木犀草素（種子）4,7′-二羥基黃酮豌豆豌豆根瘤菌橙皮素12豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)二根瘤菌分泌結(jié)瘤因子1結(jié)瘤因子的結(jié)構(gòu)2結(jié)瘤因子的合成3結(jié)瘤因子的功能13豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)1結(jié)瘤因子的結(jié)構(gòu)

根瘤菌分泌的脂酰幾丁質(zhì)寡聚糖（LCO)（即脂?；?N-乙酰葡糖胺寡聚物）。

NodC（聚乙酰氨基葡糖合成酶）NodF、E（酰基載體蛋白、酮脂酰合成酶）NodB（脫乙酰酶）NodL（乙酰轉(zhuǎn)移酶）NodM（葡萄糖胺合成酶）NodH(磺基轉(zhuǎn)移酶）NodP(硫酸化酶）NodQ(APS激酶）還原端非還原端14豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)2結(jié)瘤因子的合成及結(jié)瘤基因結(jié)瘤因子由黃酮類物質(zhì)誘導(dǎo)根瘤菌的結(jié)瘤基因表達(dá)而最終合成。1）共同結(jié)瘤基因2）結(jié)瘤調(diào)節(jié)基因3）宿主專一性基因4）其它結(jié)瘤基因15豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)1）共同結(jié)瘤基因nodA、B、C是根瘤菌中最保守的基因，即在不同的根瘤菌中同源性很高，功能上可以在不同根瘤菌之間相互交換而不改變其宿主范圍，一種根瘤菌的基因突變可以被其它根瘤菌的相應(yīng)基因所互補(bǔ)。nodABC在基因組內(nèi)是緊密連在一起的，位于同一操縱子的3個(gè)閱讀框架中，轉(zhuǎn)錄方向一致。nodA

酰基轉(zhuǎn)移酶，將長鏈脂肪酯連接到聚乙酰氨基葡糖分子非還原端。nodB脫乙酰酶，催化聚乙酰氨基葡糖分子非還原端脫乙?；磻?yīng)。nodC

表達(dá)的蛋白NodC位于膜上，與聚乙酰氨基葡糖合成酶高度同源，在N—乙酰葡萄糖胺之間形成β-1,4糖苷鍵所必需。16豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)2）結(jié)瘤調(diào)節(jié)基因nodD是結(jié)瘤正調(diào)節(jié)基因，在根瘤菌中普遍存在，它的表達(dá)是組成型的，其蛋白在根際與特定的黃酮類物質(zhì)結(jié)合后可以激活nodABC及其它一系列結(jié)瘤基因的表達(dá)。在nodABC的上游區(qū)，有一段高度保守的序列，稱為結(jié)瘤盒（nod-box）,大約25-50bp，不同根瘤菌此序列長短不一，是一段調(diào)節(jié)序列，為結(jié)瘤基因轉(zhuǎn)錄激活所必需，nodD的產(chǎn)物NodD蛋白的N末端就結(jié)合在一這位置，而其C末端與特異的黃酮類化合物結(jié)合。nodD在不同的根瘤菌中拷貝數(shù)不同，在多數(shù)根瘤菌中只有一個(gè)，但有些為3，甚至5個(gè)。由于NodD蛋白與特定的黃酮類物質(zhì)結(jié)合后，才能激活相應(yīng)的結(jié)瘤基因，所以nodD在一定程度上決定根瘤菌的宿主專一性。17豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)3）宿主專一性基因不同的根瘤菌此類基因不同，基因種類也不完全一樣，它們中大部分在根瘤種內(nèi)功能是保守的，可以互補(bǔ)，種間功能不能互補(bǔ)。其功能是影響根瘤的結(jié)瘤速率一數(shù)量，更主要的是影響宿主專一性，它們的突變，會(huì)引起宿主專一性的喪失或擴(kuò)大宿主范圍。如nodE、F、G、H、P、Q、M、N、L、I等。它們中有些與結(jié)瘤因子側(cè)鏈的化學(xué)修飾有關(guān)，有些其功能目前仍不確定。18豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)4）其它結(jié)瘤基因根瘤菌在侵染宿主根毛細(xì)胞時(shí)，必須能被根毛細(xì)胞所識(shí)別，因此有許多基因決定其細(xì)胞表面組分的合成，它們包括合成根瘤菌胞外多糖的exo基因，脂多糖的lps基因，合成莢膜多糖、K抗原和β-1,2-葡聚糖的ndv基因。上述基因的突變將不同程度擾亂根瘤菌的侵染過程。19豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)三豆類植物與根瘤菌的相互識(shí)別1宿主根毛細(xì)胞表面多糖與根瘤菌表面多糖之間相互識(shí)別2宿主根毛細(xì)胞膜上結(jié)瘤因子的受體與結(jié)瘤因子的結(jié)合21豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)相互識(shí)別1植物凝集素（phytohaemoglutinins,即lectins)：很可能與這一識(shí)別有關(guān)。由于凝集素是多價(jià)的，它可以介導(dǎo)宿主根毛表面與根瘤菌細(xì)胞表面的結(jié)合。存在于根瘤菌表面的植物凝集素受體是一種脂多糖（可能是莢膜中的一種成分），稱為O－抗原。2結(jié)瘤因子受體：最近人們發(fā)現(xiàn)了NFR5、NFR1和NORK三種結(jié)瘤因子受體，它們均屬激酶類受體，前兩者主要在結(jié)瘤早期起作用，而第三可引發(fā)結(jié)瘤因子信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大。22豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)四豆類植物對(duì)根瘤菌的反應(yīng)1根毛變形2根毛質(zhì)膜去極化3根毛細(xì)胞中Ca2+的振蕩4根毛細(xì)胞中H+濃度的變化5根毛細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白纖絲的重組6根毛中根瘤菌侵染線的形成及延伸7根皮層細(xì)胞的重新分裂形成瘤狀組織8根毛細(xì)胞中結(jié)瘤素基因的表達(dá)23豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)6根毛中根瘤菌侵染線的形成及延伸（一）根毛末端細(xì)胞壁在根瘤菌的影響下內(nèi)陷，根瘤菌隨之進(jìn)入，后被局限在侵染線內(nèi)。侵染線是宿主細(xì)胞分泌的纖維素物質(zhì)包圍根瘤菌所形成的一種管狀結(jié)構(gòu)，管壁與根細(xì)胞壁類似，通常在侵入發(fā)生幾小時(shí)后就出現(xiàn)。侵染線的形成與延伸可視為是一種侵染與防御排斥相平衡的結(jié)構(gòu)。在一些不平衡的例子中，可以看到或者是根瘤菌自由地在根毛細(xì)胞內(nèi)泳動(dòng)，或者是在根瘤菌開始繁殖之前侵染線就被宿主細(xì)胞沉積的細(xì)胞壁物質(zhì)所阻斷。侵染線形成后，隨著根瘤菌的分裂，不斷向根毛基部延伸，到達(dá)根毛細(xì)胞基部的細(xì)胞壁時(shí)，在根瘤菌分泌的果膠酶的作用下，侵染線壁與細(xì)胞壁連接起來，穿過表皮細(xì)胞向根內(nèi)推進(jìn)。當(dāng)侵染線抵達(dá)皮層的3～6層細(xì)胞時(shí)，處在前方靠近內(nèi)皮層的細(xì)胞被刺激開始分裂，分化成根瘤分生組織。隨著根瘤分生組織的不斷分裂，根瘤不斷長大，在根的表面出現(xiàn)突起。不斷增大的根瘤其細(xì)胞分化為外層同時(shí)侵染線會(huì)在皮層細(xì)胞內(nèi)分支，這樣更多的皮層細(xì)胞被侵染。在侵染線生長過程中，根瘤菌不斷產(chǎn)生生長素。侵染線內(nèi)的根瘤菌多呈短桿狀，成單行或數(shù)行排列。并被自己分泌的粘多糖包圍，侵染線停止生長后，侵染線的壁為宿主皮層細(xì)胞分泌的纖維素酶所溶解，根瘤菌則被釋放進(jìn)入宿主細(xì)胞中，1～16個(gè)細(xì)菌共同包在外膜中，這時(shí)根瘤菌脫去外壁分化為類菌體，才開始固氮。而宿主細(xì)胞喪失分生能力，由鄰近皮層細(xì)胞分裂形成分生組織。24豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)6根毛中根瘤菌侵染線的形成及延伸（二）對(duì)于無限根瘤來說，侵染線中釋放出根瘤菌后，這些細(xì)胞中的根瘤菌分化成類菌體形態(tài)并開始固氮。鄰近的分生組織不斷分裂，瘤組織變大，逐漸穿過皮層向外長出；侵染線隨之也折轉(zhuǎn)方向由內(nèi)向外延伸，侵染新生成的瘤組織細(xì)胞。這一過程一直進(jìn)行到根瘤從根上長出相當(dāng)長時(shí)間后才停止。時(shí)間長短隨種類不同而異。有限型根瘤，根瘤的分生組織通常是短命的，瘤內(nèi)被感染細(xì)胞的老幼差別不顯著，根瘤壽命一般短于無限型根瘤。25豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)五根瘤發(fā)育根瘤的發(fā)育起始于主根靠根毛附近的皮層細(xì)胞分裂，而這一過程的觸發(fā)最終源于宿主細(xì)胞對(duì)結(jié)瘤因子等信號(hào)物質(zhì)的感知，然而根瘤本身是一個(gè)完整的器官，如無限型根瘤（豌豆根瘤）主要結(jié)構(gòu)有：

①根瘤表皮和皮層；②分生組織（有限型無分生組織，如大豆根瘤）；③感染區(qū)（包括早期共生區(qū)、成熟區(qū)和衰敗區(qū)）；④維管束；⑤細(xì)胞間隙；因此，根瘤的發(fā)育除了受結(jié)瘤因子的作用外，必然涉及多種植物激素的共同調(diào)節(jié)。26豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)植物激素對(duì)根瘤發(fā)育的影響1生長素：對(duì)根瘤的發(fā)育有雙重調(diào)節(jié)作用。根瘤發(fā)育起始，根中生長素的含量很低，有利于根瘤原基的形成，而之后其含量會(huì)升高這樣可以抑制其它根瘤原基的形成。2細(xì)胞分裂素：已經(jīng)檢測(cè)到豌豆幼齡根瘤和發(fā)育中的根瘤含有較高的細(xì)胞分裂素，而成熟的根瘤中其含量很低。人們推測(cè)這種含量的差異可能是結(jié)瘤因子影響的結(jié)果。3乙烯和脫落酸均可抑制根瘤的形成，從而可以控制根瘤的數(shù)量。4

赤霉素可以促進(jìn)結(jié)瘤。27豆科根瘤分子細(xì)胞生物學(xué)六根瘤成熟并開始固氮成熟根瘤中會(huì)合成大量的豆血紅蛋白，以便為類菌體提供氧氣，并維持低氧水平，以保證對(duì)氧敏感