球蛋白的分離純化與鑒定

球蛋白的分離純化與鑒定第1頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogoContents實驗?zāi)康呐c要求實驗原理操作步驟結(jié)果分析1234第2頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo血清-球蛋白的分離、純化及鑒定一、實驗?zāi)康呐c要求了解分離純化蛋白質(zhì)的基本原理；掌握柱層析技術(shù)。第3頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo二、實驗原理

本實驗為一綜合性大實驗，目的是要從血清中獲得純化的-球蛋白。血清-球蛋白的分離、純化及鑒定血清中的蛋白質(zhì)有兩大類：清蛋白和球蛋白（、、）。（一）如何分離得到球蛋白？鹽析：清蛋白在水中的溶解度大于球蛋白，在血清中加入硫酸銨至半飽和時，球蛋白可被完全沉淀，而絕大部分清蛋白保持溶解狀態(tài)，依此可將球蛋白和清蛋白分離(離心）。得到球蛋白第4頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo二、實驗原理

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定（二）如何去除球蛋白中的無機鹽（硫酸銨）？凝膠層析（凝膠過濾）脫鹽凝膠層析又稱凝膠過濾，是選用孔隙大小一定的凝膠，將混合液中的小分子和大分子物質(zhì)“篩”開來的一種分離方法。葡聚糖G-25純化的球蛋白第5頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo二、實驗原理

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定（三）如何分離得到純化的-球蛋白？在乙酸銨溶液（pH6.5）中

、-球蛋白帶負(fù)電荷而-球蛋白帶正電荷第6頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo二、實驗原理

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定（三）如何分離得到純化的-球蛋白？如何將帶有不同性質(zhì)電荷的蛋白質(zhì)分離呢？離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。離子交換是指溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的交換過程；帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱陽離子交換劑。本實驗采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，其分子帶電形式為：纖維素-OC2H4N+H(C2H5)2，溶液中帶負(fù)電荷的離子可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的。第7頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo血清-球蛋白的分離、純化及鑒定+第8頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo二、實驗原理

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定（三）如何分離得到純化的-球蛋白？因、球蛋白帶負(fù)電荷而與DEAE纖維素進(jìn)行交換結(jié)合。而-球蛋白帶正電荷而不與DEAE纖維素進(jìn)行交換結(jié)合，直接從層析柱流出。故經(jīng)DEAE纖維素陰離子交換層析流出的第一部分蛋白質(zhì)即為純化的-球蛋白。

純化前后的-球蛋白可用電泳法進(jìn)行比較鑒定。

（四）如何鑒定-球蛋白及純度？第9頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo二、實驗原理

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定1.鹽析：分離球蛋白與清蛋白。

2.凝膠層析：去除球蛋白中的無機鹽（脫鹽）。3.離子交換層析：將-球蛋白與、-球蛋白分離。4.電泳：鑒定-球蛋白及純度。第10頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo三、操作步驟

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定1.鹽析：分離球蛋白與清蛋白

取血清0.75ml，緩慢滴入飽和(NH4)2SO4溶液0.75ml，邊加邊搖，混勻后于室溫中放置10分鐘，然后10000rpm離心10分鐘，并小心傾去上清液。沉淀加蒸餾水0.4ml，使之溶解，即為粗提的球蛋白溶液。第11頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo三、操作步驟

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定2.凝膠層析：去除球蛋白中的無機鹽

（脫鹽）（1）裝柱：（a）固定層析柱，保持垂直。（b）排氣，并檢查是否通暢。柱內(nèi)留下約5ml乙酸銨。（c）灌膠：用滴管沿管壁自頂部加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，打開底部出口，凝膠隨柱內(nèi)溶液慢慢流下而均勻沉降，不斷加入SephadexG-25，至凝膠層積集至約15cm高度即可，床面上保持有少許溶液。關(guān)閉出口。

避免氣泡、紋路，凝膠面始終低于液面。

如凝膠表面不平時，可用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，使表層平整。第12頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo三、操作步驟

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定（2）上樣與洗脫：凝膠面始終低于液面使柱上緩沖液面剛好下降到凝膠床表面

用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢地加到凝膠床表面上

然后打開下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床，關(guān)閉出口

小心加入少量乙酸銨（約1ml）洗層析柱內(nèi)壁上的樣品，打開出口，使溶液進(jìn)入凝膠

加入適量乙酸銨溶液開始洗脫并收集洗脫液，每分鐘收集15滴

淡黃色仔細(xì)清洗試管第13頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo三、操作步驟

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定（3）洗脫液中蛋白質(zhì)的檢測：

按洗脫液的管號順序分別取1滴液體，滴于玻片上，滴加20％磺基水楊酸1滴，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有蛋白質(zhì)析出，由此可估計蛋白質(zhì)在洗脫各管中的分布及濃度。合并蛋白含量高的各管，此即已脫鹽的球蛋白溶液，除留少量作電泳鑒定用外，其余用于DEAE-纖維素陰離子交換柱。最多合并三管即可第14頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo三、操作步驟

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定3.離子交換層析：將-球蛋白與、-球蛋白分離。（1）裝柱、上樣、洗脫、收集及蛋白質(zhì)檢測裝柱、上樣、洗脫、收集及蛋白質(zhì)檢測等操作步驟及有關(guān)注意事項同前述。上樣前DEAE-纖維素柱的平衡：裝柱后用0.02M乙酸銨（pH6.5）沖洗2遍。將脫鹽后含球蛋白的溶液加于DEAE-纖維素陰離子交換柱上，用乙酸銨洗脫，樣品進(jìn)入柱床后立即開始收集洗脫液，檢查各管的蛋白質(zhì)分布情況，合并含量高的各管。留少量做電泳此次收集的即為純化的-球蛋白溶液，留待濃縮及鑒定。第15頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo三、操作步驟

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定（2）濃縮將純化的-球蛋白溶液量體積，每毫升加葡聚糖凝膠G-25干膠0.25g，搖動2-3分鐘，離心5分鐘（10000r/min），上清即為濃縮的-球蛋白溶液，留待電泳鑒定。第16頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo三、操作步驟

血清-球蛋白的分離、純化及鑒定4.電泳：鑒定-球蛋白及純度（比較純化前后的蛋白質(zhì)）

每組取醋酸纖維素薄膜3張，按如下操作：樣品：(1)血清；(2)凝膠層析脫鹽后的球蛋白溶液；(3)DEAE-纖維素陰離子交換柱純化后的-球蛋白液

電泳及染色：方法同醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白實驗。（點樣面朝下、點樣端靠近負(fù)極，氨基黑10B染色）不可重復(fù)點樣須重復(fù)點樣須重復(fù)點樣，約15次左右第17頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月CompanyLogo血清-球蛋白的分離、純化及鑒定葡聚糖G-25和DEA