生物分離工程電泳

生物分離工程電泳1第1頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳在生化分離中的應(yīng)用分離和純化手段（實(shí)驗(yàn)室）

蛋白、酶、核酸純化基礎(chǔ)理論研究

醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白

瓊脂對流免疫電泳分析病人血清，早期診斷肝癌

高壓電泳分離肽段，研究蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)；

凝膠電泳技術(shù)分離分析酶，蛋白質(zhì)，核酸2第2頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳原理指帶電粒子在電場中朝與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象CATHODEANODE+--+3第3頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月帶電顆粒小離子：Cl-,甘氨酸離子

生物大分子：蛋白質(zhì)、核酸等

蛋白質(zhì)分子是由氨基酸組成的，而氨基酸帶有可解離的氨基和羧基，是典型的兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下就會解離而帶電

4第4頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月用支持體的電泳技術(shù)1.濾紙電泳2.醋酸纖維薄膜電泳3.薄層電泳4.非凝膠性支持體區(qū)帶電泳(淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)5.凝膠支持體區(qū)帶電泳(聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠)不用支持體的電泳技術(shù)Tiselius或微量電泳

操作形式：1.區(qū)帶電泳2.等速電泳3.等電點(diǎn)電泳電泳形式分類5第5頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳速度v=EZe/(6пrη)+--Z，rEf’fE:電場強(qiáng)度,V/cmZ:

溶質(zhì)的荷電荷數(shù)η：溶液粘度e:1.610-19C1.粒子在電場中所受的力:

f=EZe2.粒子在液體中泳動所受的阻力：根據(jù)Stoke定律f′=6пrηv平衡時(shí)：f=f’恒定泳動速度:溶質(zhì)的遷移率：u0=v/E=Ze/(6пrη)6第6頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月區(qū)帶電泳7第7頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動速度的因素FrictionCharge外加電流電壓分子量分子形狀分子的等電點(diǎn)Voltage+--+8第8頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動速度的因素-1

帶電顆粒的性質(zhì)

所帶凈電荷的數(shù)量

顆粒大小

形狀

v=EZe/(6пrη)恒定泳動速度:9第9頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動速度的因素-2

粒子的pI和溶液pH值

protein白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白pI4.05.065.17.1白蛋白

>

α2球蛋白

>β球蛋白

>γ球蛋白血清中的四種蛋白pH8.6的電泳緩沖液中電泳，泳動速度：10第10頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動速度的因素-3

外加電流電壓

U，E，v(1)常壓電泳:

U=100~500V，E=2~10V/cm

t=幾小時(shí)至數(shù)天

適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)(2)高壓電泳：U=500~1000V，E=50~200V/cm

t=幾分鐘

分離氨基酸，肽，核苷酸，糖類等小分子物質(zhì)

由于電壓升高，電流也隨之增大，故需冷卻裝置

v=EZe/(6пrη)恒定泳動速度:11第11頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動速度的因素-4

溶液的離子強(qiáng)度I=(∑cizi2)/2

—保持足夠緩沖能力前提下，離子強(qiáng)度要最小—溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動速度越慢，反之越快

—最適離子強(qiáng)度0.02–0.2

12第12頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動速度的因素-5

電滲作用

在電場中液體對固體支持物的相對移動濾紙電泳CellulosepH=8.6電泳血清蛋白+-γ球蛋白-濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負(fù)電荷與帶電顆粒一樣可以吸引正離子介質(zhì)向陰極移動γ球蛋白:顆粒大，凈電荷少13第13頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月電滲作用—石英毛細(xì)管電泳

CapillaryElectrophoresis

pH>3內(nèi)表面帶負(fù)電毛細(xì)管管壁分布有

大量的硅烷醇（Si-OH）陽離子被吸附在管壁而形成了雙電層

V=V(電滲流)＋V(電泳)V(正)>V(中)>V(負(fù))14第14頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動速度的因素-6

對支持物的選擇

支持物均勻，吸附力小，否則電場強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離

瓊脂糖和淀粉在電場作用下易電離帶負(fù)電荷，產(chǎn)生電滲流，應(yīng)用范圍受限制。聚丙烯酰胺凝膠常用。15第15頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月Example1

計(jì)劃在0.82v/cm的電位梯度下，用凝膠電泳的方法將兩種胞外蛋白質(zhì)分離開來，這兩種蛋白質(zhì)的遷移率分別為4.110-5和5.110-5cm2/V.s。如果開始時(shí)混合物在凝膠上寬度為0.2cm，估計(jì)把這兩種蛋白質(zhì)分開需多長時(shí)間？在估算時(shí)，可忽略擴(kuò)散的影響。

u0=v/E=eZ/（6пrη）解：溶質(zhì)的遷移率為：16第16頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠電泳17第17頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

凝膠電泳法鑄膠電泳染色脫色凝膠電泳樣本處理Trypsin濃縮層膠體分離層膠體取出膠體染色脫色18第18頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月Pierce商品供應(yīng)預(yù)鑄膠片梯度或固定濃度膠體10,12.15樣本槽中性pH緩沖液拋棄式塑料外殼膠體1mm厚度19第19頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)組成1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層(負(fù)極)緩沖液2樣本溶液3濃縮層膠體6.84分離層膠體膠體5下層(正極)緩沖液Tris-HClTris-HClTris-glycineTris-glycineTris-glycine8.38.38.38.35%7.5~20%---●膠體不連續(xù)性有濃縮樣品的作用20第20頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月濃縮層內(nèi)的等速電泳21第21頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月濃縮層膠體中的三個(gè)主要作用角色Glycine:Negativecharged

Nonetcharge

Chlorideion:Proteins:小分子大分子22第22頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月SDSGelElecrtophoresis23第23頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS測定蛋白質(zhì)相對分子量PAGE凝膠電泳分離、檢測蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀及凈電荷

在PAGE中加入一定量的SDS

蛋白質(zhì)分子的遷移速度主要取決于分子量大小24第24頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS測定蛋白質(zhì)相對分子量SDS：陰離子去污劑、水溶液中以單體和分子團(tuán)存在。能破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其他分子間的非共價(jià)鍵，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，使蛋白質(zhì)喪失了原有電荷狀態(tài)，形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)。25第25頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS測定蛋白質(zhì)相對分子量操作：分離膠12%濃縮膠5%加樣電泳染色、脫色凝膠干燥確定分子量26第26頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品分子量的確定M為蛋白質(zhì)分子量、m相對遷移率、b為斜率、K為截距。一定條件下K和b為常數(shù)，根據(jù)遷移率可求得分子量。lgMw=b*mR+K

蛋白質(zhì)分子量在15000-200000之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對手呈線性關(guān)系：27第27頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品分子量的確定相對遷移距離=蛋白質(zhì)遷移距離/燃料遷移距離

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子量的對數(shù)(lgMr)為縱座標(biāo)，相對遷移距離為橫座標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。28第28頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較MolecularWeightpINativePAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternaryStructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+29第29頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月單元體分子量的測定：SDS