重組HSV-Ⅱ新型溶瘤病毒疫苗可行性報(bào)告

wordword資料重組HSV-U新型溶瘤病毒疫苗可行性報(bào)告摘要：經(jīng)過(guò)重組減毒的H型溶瘤單純皰疹病毒在體外具有良好的溶瘤效果，經(jīng)過(guò)研究，目前已經(jīng)能建立以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的重組HSV—H病毒疫苗反應(yīng)器微載體無(wú)血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝，最大病毒滴度可達(dá)到6.62lgTCID50/ml以上。為以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的無(wú)血清病毒疫苗規(guī)?；囵B(yǎng)提供了一種簡(jiǎn)便、高效的工藝方法，可計(jì)劃用于工業(yè)化生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：重組HSV-n；Vero細(xì)胞；生物反應(yīng)器；微載體培養(yǎng)正文：1.產(chǎn)品的意義：目前惡性腫瘤已超過(guò)心腦血管類疾病成為首位人類致死性疾病,采用Vero細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的重組溶瘤性n型單純皰疹病毒(HSV-n)具有良好的溶源性、靶向性和安全性,具有重要的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)人類腫瘤疫苗的有關(guān)研究處于剛起步狀態(tài)，面臨多重難題，建立高效的腫瘤疫苗生產(chǎn)工藝具有非常重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。經(jīng)過(guò)重組減毒的n型溶瘤單純皰疹病毒作為高效新型病毒疫苗有望用于腫瘤的臨床研究。尉舟不班u犧『iwZcrmalColls圖1.溶瘤病毒的作用機(jī)制2.生產(chǎn)材料：細(xì)胞培養(yǎng)：Vero細(xì)胞病毒株：重組n型溶瘤單純皰疹病毒HSV—II，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。③微載體：Cytodex1④生物反應(yīng)器圖2.產(chǎn)品外觀圖3.圖2.產(chǎn)品外觀圖3.Cytodex1微載體圖4.Vero細(xì)胞圖5.生物反應(yīng)器3.經(jīng)濟(jì)效益：經(jīng)查閱ATCC，Vero細(xì)胞為免費(fèi)（不包郵）；病毒株需向中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所申請(qǐng)?zhí)峁◣缀趺赓M(fèi)）；微載體Cytodex1市價(jià)為3元/瓶；生物反應(yīng)器可租借。成本保守估計(jì)（不算設(shè)備使用費(fèi)）：每支成本約為6元，預(yù)售價(jià)為98元，除去設(shè)備費(fèi)和人工生產(chǎn)費(fèi)，約可凈得利潤(rùn)30RMB/支（1ml）。4.生產(chǎn)工藝流程：軸將禪干高壓菠丙間Iriiitrft€ffn暫存働__*鑽版?zhèn)乳WT4.生產(chǎn)工藝流程：軸將禪干高壓菠丙間Iriiitrft€ffn暫存働__*鑽版?zhèn)乳WTLF湖1L7如I［間L圖6.生產(chǎn)車間流程圖在反應(yīng)罐培養(yǎng)間中進(jìn)行重組HSV—H病毒疫苗的微載體懸浮培養(yǎng)，步驟如下：Cytodex1微載體制備：稱取一定量Cytodexl置于二甲基二氯硅烷硅化的轉(zhuǎn)瓶/瓶子，加入PBS(pH7-2)水化，比例約為80?150mL/gCytodex1，約3h后將PBS傾去，加入新PBS繼續(xù)水化約3h(可過(guò)夜)，傾去并用新的PBS洗滌一次。高壓滅菌121°C，30min，冷卻后傾去PBS，用培養(yǎng)基洗滌一次后傾去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置4°C冰箱平衡過(guò)夜，待用°PBS繼續(xù)水化約3h(可過(guò)夜)，傾去并用新的PBS洗滌一次。高壓滅菌121°C，30min，冷卻后傾去PBS，用培養(yǎng)基洗滌一次后傾去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置4?C冰箱平衡過(guò)夜，待用。Vero細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)：Cytodex1濃度為3g/L，接種密度20?30cells/MC，轉(zhuǎn)速45r/min，溫度37~C，溶解氧濃度(D0)通過(guò)Air，0和N：的進(jìn)氣比控制在40％空氣飽和度，pH通過(guò)調(diào)節(jié)C0的進(jìn)氣量和7．5％(w/v)NaHC0控制在7-15?7?2，進(jìn)行1?5L/5L反應(yīng)器培養(yǎng)。Vero細(xì)胞的微載體球轉(zhuǎn)球轉(zhuǎn)移培養(yǎng)：ero細(xì)胞于轉(zhuǎn)瓶/反應(yīng)器微載體上培養(yǎng)2?4d，待長(zhǎng)成單層時(shí)，向培養(yǎng)基中加入一定體積的新微載體，與長(zhǎng)滿細(xì)胞的老微載體按照一定比例混合，進(jìn)行間歇/連續(xù)攪拌培養(yǎng)，待細(xì)胞轉(zhuǎn)移貼附成功后，進(jìn)行常規(guī)連續(xù)攪拌培養(yǎng)。Vero細(xì)胞的微載體在位消化轉(zhuǎn)移培養(yǎng)：Vero細(xì)胞于轉(zhuǎn)瓶/反應(yīng)器微載體上培養(yǎng)2?4d，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，即處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行在位消化轉(zhuǎn)移培養(yǎng)。首先停止攪拌，待微載體沉降完全后將培養(yǎng)基排出，用37~C溫浴的PBS以約150mlPBS/gMC的體積洗滌兩次。向微載體加入37~C溫浴的胰蛋白酶(含0?02%(W/V)EDTA50ml/gMC)緩慢攪拌約2min后傾去胰酶液，靜止待細(xì)胞變圓后，以一定的比例加入含新微載體的培養(yǎng)基，并以一定轉(zhuǎn)速快速攪拌約2min后，補(bǔ)足培養(yǎng)基并以35?40r/min的初始攪拌轉(zhuǎn)速連續(xù)攪拌培養(yǎng)。約培養(yǎng)12h待細(xì)胞在微載體上完全貼附后，將微載體懸液放大到下一級(jí)生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。重組HSV-H病毒的反應(yīng)器培養(yǎng)：Vero細(xì)胞于反應(yīng)器微載體上培養(yǎng)2?4d，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%?90%匯合時(shí)，接種病毒。接毒時(shí)將反應(yīng)器培養(yǎng)基排出并用PBS洗滌2次，加入含BSA的無(wú)血清病毒維持液(VD-LSM)，同時(shí)將培養(yǎng)溫度由37~C降為32%進(jìn)行病毒培養(yǎng)。待細(xì)胞病變至80%?90%后，將培養(yǎng)液進(jìn)行4~C鹽裂解，收獲病毒。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用Reed—Munch公式計(jì)算TCID50。待細(xì)胞病變后收獲病毒。5?高效構(gòu)建技術(shù)路線：利用病毒活性增效劑(輔助因子)與重組HSV—H病毒疫苗共同左右增強(qiáng)產(chǎn)品效力。具體方案如下：首先選擇幾種能夠增強(qiáng)病毒活性的增效劑M1,M2,M3,M4，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)選出能夠有效增強(qiáng)該溶瘤病毒的增效劑。設(shè)置5個(gè)相同的培養(yǎng)基(合適的PH，溫度和滲透壓)放入等量腫瘤細(xì)胞作為唯一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1-4號(hào)分別加入相同劑量的M1,M2,M3,M4增效劑，5號(hào)加入等量生理鹽水作為對(duì)照。放在適宜的環(huán)境下培養(yǎng)一定時(shí)間后分別對(duì)5個(gè)培養(yǎng)基中的腫瘤活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)并腫瘤活細(xì)胞最少的那一組，可以初步得出最佳增效劑。后期反復(fù)實(shí)驗(yàn)已確定前面結(jié)果的正確，最后選出最佳增效劑并適量加入到溶瘤病毒疫苗中，確認(rèn)其安全性后投入到臨床應(yīng)用。6．產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)格：本品為注射劑，1ml/支.每1次人用劑量為1ml，病毒滴度＞=6.00lgTCID50/ml;重金屬：含重金屬不得超過(guò)百萬(wàn)分之十;接種部位：手臂三角肌肌肉。無(wú)菌檢査：依法檢査(通則1101)，應(yīng)符合規(guī)定;重組病毒疫苗的GMP標(biāo)準(zhǔn)：在工作場(chǎng)所，保護(hù)工人遠(yuǎn)離生物制劑暴露的風(fēng)險(xiǎn)；操作規(guī)，正確謹(jǐn)慎處理轉(zhuǎn)基因釋放的(微)生物體或生物體含有重組DNA分子；保證人或獸用生物制品和藥品的安全性，vero細(xì)胞來(lái)源的安全性等。7.參考文獻(xiàn)：MontagnonB，F(xiàn)angetB，NicolasA．Thelarge—scalecultivationofVEROcellsinmicro-carriercultureforvirusvaccineproduction．Preliminaryresultsforkilledpoliovirusvaccine．Developmentsinbiologicalstandardization，1981．47：55．BarrettPN，MundtW，KistnerO，eta1．Verocellplatforminvaccineproduction：movingtowardscellculture—basedviralvaccines．Expertreviewofvaccines，2009，8(5)：607-618．DennehyPH．Rotavirusvaccines：anoverview．Clinicalmicrobiologyreviews，2008，21(1)：198-208．TauberE，KollaritschH，KorinekM，eta1．SafetyandimmunogenicityofaVero—cell—derived，inactivatedJapaneseencephalitisvaccine：anon-inferiority，phaseIII，randomisedcontrolledtria1．TheLancet，2007，370(9602)：1847—1853．HowardMK，KistnerO，BarrettPN．Pre-clinicaldevelopmentofcellculture(Vero)—derivedH5N1pandemicvaccines-Biologicalchemistry，2008，389(5)：569-577．AhmedinJemal，F(xiàn)reddieBray，MelissaMCenter，eta1．Globalcancerstatistics．CA(acancerjoumalforclinicians)，2011，61(2)：69-90．MichaelJT，JohnOD，MelissaMC．Theglobalbu~enofcancer：prioritiesforprevention．LifeSciencesandMedicine，2010，31(1)：100—110．AudreyLR，DanielleJ，JuliaT，eta1．ScalableproductionofinfluenzavirusinHEK-293cellsforefficientvaccinemanufacturing．Vaccine，2010，28(21)：3661—3671．AllenChen，SwanLP，Christi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