液相色譜實(shí)驗(yàn)報(bào)告英科新創(chuàng)

液相色譜分析混合樣品中的抗原純度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握高效液相色譜定性和定量分析的原理及方法；2、了解高效液相色譜的構(gòu)造、原理及操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理高效液相色譜由儲(chǔ)液器，泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成，儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附—解吸的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀。三、主要儀器和試劑主要儀器：島津液相色譜儀(LC-10AT)［配有紫外檢測(cè)器，PhenomenexODS柱］;1OpL微量注射器試劑：苯標(biāo)準(zhǔn)溶液：10.0pL/mL；甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液：10.0pL/mL；苯、甲苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：10.0pL/mL；甲醇：80%；苯和甲苯混合待測(cè)溶液；四、實(shí)驗(yàn)步驟1、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制系列用1OOpL的微量注射器分別量取1OpL、2OpL、50pL、1OOpL的苯和甲苯的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1O.OpL/mL)，再分別加入9OpL、8OpL、5OpL、OpL甲醇將其稀釋，作為待測(cè)液，其濃度分別為1pL/mL、2pL/mL、5pL/mL、1OpL/mL2、色譜條件優(yōu)化按操作規(guī)程開機(jī)，并調(diào)好色譜條件，使儀器處于工作狀態(tài)?？刂屏鲃?dòng)相流速為甲醇:O.8mL/min、水：O.2mL/min；柱溫3O°C；檢測(cè)波長254nm；觀察記錄保留時(shí)間，通過軟件分析兩峰分離效果。改變色譜條件，控制流動(dòng)相流速為甲醇：0.95mL/min、水：0.05mL/min；柱溫30C；檢測(cè)波長254nm；觀察記錄保留時(shí)間，通過軟件分析兩峰分離效果。通過觀察兩種色譜條件下的峰分離效果，選擇最佳的色譜條件。若還不能達(dá)到最佳的分離效果，可以再設(shè)定不同的色譜條件，然后根據(jù)峰分離效果，選擇最佳的色譜條件。3、苯、甲苯定性分析在最佳條件下，待基線走穩(wěn)后，用10pL微量注射器分別進(jìn)樣5pL苯和甲苯混合待測(cè)溶液，5pL苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0pL/mL)和5pL甲苯標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0pL/mL)(微量注射器用甲醇潤洗3~5遍)，觀察并記錄色譜圖上顯示的保留時(shí)間，確定苯和甲苯的峰。4、苯、甲苯定量分析最佳條件下，待基線走穩(wěn)后，用10pL微量注射器分別進(jìn)樣1.0pL/mL、2.0pL/mL、4.0pL/mL、10.0pL/mL的苯和甲苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5pL。觀察并記錄各色譜圖上的保留時(shí)間和峰面積。繪制苯和甲苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積與相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、苯和甲苯混合待測(cè)溶液分析最佳條件下，待基線走穩(wěn)后，用10pL微量注射器進(jìn)樣苯和甲苯混合待測(cè)液5pL，觀察并記錄各色譜圖上的保留時(shí)間和峰面積。根據(jù)峰面積在工作曲線上查出苯和甲苯待測(cè)液的濃度，并計(jì)算試樣中苯和甲苯的含量。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析高效液相色譜數(shù)據(jù)報(bào)告一、色譜條件優(yōu)化二、定性分析0.00.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min

樣品苯甲苯保留時(shí)間3.7654.917三、 定量分析苯、甲苯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為：1ul/ml,2ul/ml,5ul/ml,。10ul/ml4.3.3.2.2.1.1.0.0.0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0min

苯甲苯苯甲苯四、 未知樣品濃度未知樣品苯甲苯濃度22.7ul/ml3.6ul/ml濃度12.9ul/ml3.6ul/ml六、 實(shí)驗(yàn)討論由于實(shí)驗(yàn)中待測(cè)溶液的組分只有苯和甲苯兩種物質(zhì)，組分比較簡單，只要在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制且定量進(jìn)樣，就能采用操作、計(jì)算簡便的標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。若采用歸一化法或內(nèi)標(biāo)法，雖然能得到準(zhǔn)確更高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但由于實(shí)驗(yàn)操作及計(jì)算均較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理的時(shí)間長，效率相對(duì)不高，故實(shí)驗(yàn)中采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法作為定量的方法。最佳色譜條件的選擇是本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。若苯與甲苯的峰分離效果過小，苯與甲苯的峰未能完全分離，必定影響其保留時(shí)間和峰面積的計(jì)算，是實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度減小，數(shù)據(jù)誤差加大；若苯與甲苯的峰分離效果過好，雖然能將苯與甲苯的峰完全分離，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度好，但是耗費(fèi)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長，效率不好。因而，應(yīng)選擇合適的色譜條件。為了提高標(biāo)準(zhǔn)曲