第九章酶的非水相催化課件

EnzymaticcatalysisinNon-aqueoussystem

酶在非水介質(zhì)中進行的催化作用稱為酶非水相催化第六章酶的非水相催化

有機介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。6.1.1有機介質(zhì)中的酶催化6.1.2氣相介質(zhì)中的酶催化

酶在氣相介質(zhì)中進行的催化反應(yīng)。適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。6.1.3超臨界流體介質(zhì)中的酶催化

酶在超臨界流體中進行的催化反應(yīng)。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質(zhì)超臨界點的流體。6.1.4離子液介質(zhì)中的酶催化

在離子液中進行的催化作用。離子液（ionicliquids）是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構(gòu)成的，在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。6.2有機介質(zhì)中水和有機溶劑對酶催化反應(yīng)的影響6.2.1有機介質(zhì)反應(yīng)體系（1）微水介質(zhì)體系(含水量一般小于2%)酶以凍干粉或固定化酶的形式懸浮于有機溶劑中，在懸浮狀態(tài)下進行反應(yīng)。（4）膠束體系（5）反膠束體系反相膠束與生物膜有相似之處適用于生物膜表面或與膜結(jié)合的酶的結(jié)構(gòu)、催化特性和動力學(xué)性質(zhì)研究。（酶被限制在含水的微環(huán)境中，而底物和產(chǎn)物可以自由進出膠束）看圖正、反膠束體系“鋼性”與”柔性”的動態(tài)平衡（維持酶催化活性）“緊密”：酶分子內(nèi)的氫鍵“開啟”：酶分子間的氫鍵a．不同酶需水量不同b.同一種酶在不同有機溶劑中需水量不同溶劑疏水性越強，需水量越少剛性：生物大分子結(jié)構(gòu)的精確性柔性：生物大分子局部區(qū)域具有一定的可運動性。6.2.2水對有機介質(zhì)中酶催化的影響生物催化劑必需水層（1）必需水（essentialwater）：

緊緊吸附在酶分子表面，維持酶催化活性所必需的最少量水。（1）與酶分子表面帶電基團結(jié)合達到0-0.07g/g（水/酶）：一個酶分子周圍有0-60個水分子，蛋白質(zhì)自由度無，酶活無（2）與表面的極性基團結(jié)合(0.07-0.25g/g)：一個酶分子周圍有60-220個水分子，蛋白質(zhì)自由度上升，顯示出酶活（3）凝聚到表面相互作用較弱的部位（0.25~0.38g/g）：一個酶分子周圍有220-300個水分子，蛋白質(zhì)自由度上升，最大酶活（4）酶分子表面完全水化，被一層水分子覆蓋。：酶分子周圍的水分子達到300以上，酶活降低，自由度最大干燥的酶水合過程：有機溶劑的極性lgP——極性參數(shù)P：溶劑在正辛烷與水兩相中的分配系數(shù)

研究表明，有機溶劑的極性越強，越容易奪取酶分子結(jié)合水，對酶活力的影響就越大。用有機溶劑極性參數(shù)lgP描述有機溶劑的極性與酶活力之間的關(guān)系溶劑極性對酶活性影響的規(guī)律（Laane規(guī)律）lgP性質(zhì)水中溶解度/%(20℃)對酶活性的影響≤2

極性溶劑＞0.4容易使酶失活，較少使用＞2，＜4中等極性0.04～0.4酶的活性難以預(yù)測，小心使用。可以表現(xiàn)酶活≥4非極性＜0.04不會引起酶的變性，能保持酶的高活性（1）有機溶劑對酶必需水的影響極性弱的溶劑：影響小極性強的溶劑：奪取酶必需水疏水性溶劑：不易溶解吸附酶必需水酶的失水與溶劑的極性參數(shù)（lgP）和介電常數(shù)（ε）相關(guān)，與系統(tǒng)中底物的極性、底物濃度和含水量均有關(guān)系催化過程：S→E-S→E-P→P（水相反應(yīng)）S→watershell→E-S→E-P→P→organicphase（非水介質(zhì)）主要推動力：底物-酶之間的結(jié)合能OrganicSolventE-SE-P底物分子必須先進入酶分子的必需水層，再進入到酶活性中心完成催化過程，產(chǎn)物同樣需要先進入水層再轉(zhuǎn)移到反應(yīng)介質(zhì)。（2）有機溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響+底物與有機介質(zhì)的極性差異N—Ac—L—PheOEtN—Ac—L—SerOEt疏水性底物親水性底物叔丁醇或叔丁胺親水性溶劑CH2Cl2疏水性溶劑subtilisin

反應(yīng)快反應(yīng)快許多酶活性中心是疏水性的，容易與疏水性底物結(jié)合進行反應(yīng)，疏水性底物容易從水中析出到達疏水性活性中心。在疏水性強的有機溶劑中，疏水性底物與有機溶劑間的相互作用增強，底物從溶劑中到達活性中心比在水中困難，從而酶催化反應(yīng)速度減慢。極性小疏水性強底物在有機溶劑中溶解度大難于進入必需水層極性大親水性強底物在有機溶劑中溶解度小，底物濃度降低有機溶劑催化速度降低適宜lgP：２≤

lgP≤5（疏水性底物）有機溶劑對酶催化反應(yīng)的影響：酶的活性和穩(wěn)定性酶的底物特異性、對映體選擇性、潛手性選擇性、位置選擇性、化學(xué)鍵選擇性原因：與必需水作用與底物和產(chǎn)物作用改變酶蛋白的結(jié)構(gòu)與柔韌性改變酶促反應(yīng)動力學(xué)特征有機溶劑主要通過以下三種途徑發(fā)生作用:一是有機溶劑與酶直接發(fā)生作用通過干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象從而導(dǎo)致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有機溶劑和能擴散的底物或反應(yīng)產(chǎn)物相互作用影響正常反應(yīng)的進行;三是有機溶劑還可以直接和酶分子周圍的水相互作用6.3有機溶劑對有機介質(zhì)中酶催化的影響6.4酶在有機介質(zhì)中的催化特性有機介質(zhì)對酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會產(chǎn)生一定的影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不同的催化特性.底物特異性立體選擇性區(qū)域選擇性鍵選擇性熱穩(wěn)定性活性pH值6.4.2立體選擇性

酶的立體選擇性（enantioselectivity）又稱為對映體選擇性或立體異構(gòu)專一性，是酶在對稱的外消旋化合物中識別一種異構(gòu)體的能力大小的指標。實驗表明：疏水性越強的溶劑，酶的立體選擇性越6.4.3位置選擇性酶能夠選擇底物分子中某一區(qū)域的基團優(yōu)先進行反應(yīng)。位置特異性：酶可以選擇性地催化底物中某個區(qū)域的基團發(fā)生反應(yīng)就是位置特異性，也稱區(qū)域選擇性。6.4.4化學(xué)鍵選擇性化學(xué)鍵選擇性是指當(dāng)同一個底物分子中有2個以上的化學(xué)鍵都可以與其進行反應(yīng)時，酶對其中的一個化學(xué)鍵可以優(yōu)先進行催化反應(yīng)。介質(zhì)的轉(zhuǎn)換對酶的化學(xué)鍵選擇性有不同程度的影響（2）分子記憶根據(jù)分子識別理論，酶通過配體的誘導(dǎo)、相互作用改變酶的構(gòu)象，從而獲得與配體類似物結(jié)合的能力，這種由配體誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶的記憶的方法稱為分子記憶（molecularmemory）酶蛋白分子在有機相中具有對配體的“記憶”功能。有機相生物印跡酶

枯草桿菌蛋白酶溶液

含N-Ac-Tyr-NH2

凍干除去抑制劑枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶溶液

不含N-Ac-Tyr-NH2

凍干枯草桿菌蛋白酶在辛烷中催化酯化反應(yīng)的速度比較：反應(yīng)（1）中得到的酶比反應(yīng)（2）中得到的酶高100倍在水溶液中其活性：相同掌握原理（1）（2）＋酶蛋白抑制劑凍干除去抑制劑有機溶劑水溶液枯草桿菌蛋白酶的分子記憶原理：競爭性抑制劑誘導(dǎo)酶活性中心構(gòu)象發(fā)生變化，形成一種高活性的構(gòu)象形式，而此種構(gòu)象形式在除去抑制劑后，因酶在有機介質(zhì)中的高度剛性而得到保持。水直接或間接參與了酶天然構(gòu)象中所有的非共價相互作用,水充當(dāng)了酶結(jié)構(gòu)的“潤滑劑”，使酶分子的柔性增強，原來形成的高活性構(gòu)象不再保持。（2）pH記憶和離子強度在水溶液中：pH決定酶的離子化狀態(tài)，從而影響酶的構(gòu)象，而酶的構(gòu)象又關(guān)系到酶的活性和選擇性；在有機溶劑中酶不能電離，因此必須進行預(yù)處理：將酶先溶解在少量最適pH值的緩沖溶液中，然后沉淀或凍干。這樣可以保持酶的最佳電離狀態(tài)，其活性與干燥前所處的緩沖液pH和離子密切相關(guān)，最適pH與水相中的最適pH相同。有機相中酶能夠記住最后保存其的水溶液的pH，稱為“pH記憶”（pHmemory）。從最適pH值水溶液中沉淀的酶在有機溶劑介質(zhì)中也表現(xiàn)出較高的酶活性，有時可提高一個數(shù)量級。沉淀或凍干最適pH水或緩沖液有機溶劑pH決定酶的離子化狀態(tài)→影響酶的構(gòu)象→酶的活性和選擇性可以保持酶的最佳電離狀態(tài)，“記住”最適pH最適pH與水相中的最適pH相同。有機相中酶能夠記住最后保存其的水溶液的pH，稱為“pH記憶”（pHmemory）?！皃H記憶”原因（A）有機溶劑不會改變酶蛋白帶電基團的離子化狀態(tài)，（在有機溶劑的環(huán)境中，不會發(fā)生質(zhì)子化及脫質(zhì)子化的現(xiàn)象)。所以酶在有機溶劑中的化學(xué)狀態(tài)與從中提取該酶的水溶液中的化學(xué)狀態(tài)保持相同；（B）酶在有機溶劑中結(jié)構(gòu)剛性的增加保持了之前水溶液中帶電官能團正確的離子化狀態(tài)，對酶的活性和穩(wěn)定性都非常重要。實驗現(xiàn)象：隨著凍干時用的緩沖溶液的離子強度增大，酶活會增大。6.6酶非水相催化的應(yīng)用

酶催化反應(yīng)應(yīng)用脂肪酶肽合成青霉素G前體肽合成酯合成醇與有機酸合成酯類轉(zhuǎn)酯各種酯類生產(chǎn)聚合二酯的選擇性聚合酰基化甘醇的?；鞍酌鸽暮铣珊铣啥嚯孽；穷愼；u基化酶氧化甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羥基化膽固醇氧化酶氧化膽固醇測定醇脫氫酶酯化有機硅醇的酯化應(yīng)用：6.6.1.手性藥物的拆分

手性化合物：是指化學(xué)組成相同，而其立體結(jié)構(gòu)互為對映體的兩種異構(gòu)體化合物

手性藥物一種有顯著療效，另一種有療效弱或無效一種有顯著療效，另一種有毒副作用兩種對映體的藥效相反兩種對映體具有各自不同的藥效兩種消旋體的作用具有互補性手性藥物兩種對映體的藥效差異手性藥物的拆分方法分為：非生物法、生物法非生物法（機械分離法、形成和分離對映體異構(gòu)法、色譜分離法、動力學(xué)拆分）生物拆分法原理實質(zhì)即兩個對映體競爭酶的同一個活性中心位置，兩者的反應(yīng)速率不同，產(chǎn)生選擇性，從而使反應(yīng)產(chǎn)物具有光學(xué)活性。手性藥物兩種對映體的藥理作用

藥物名稱有效對映體的作用另一種對映體的作用普萘洛爾萘普生青霉素胺羥基苯哌嗪反應(yīng)停酮基布洛芬喘速寧乙胺丁醇萘必洛爾S構(gòu)型，治療心臟病,β-受體阻斷劑S構(gòu)型，消炎、解熱、鎮(zhèn)痛S構(gòu)型，抗關(guān)節(jié)炎S構(gòu)型，鎮(zhèn)咳S構(gòu)型，鎮(zhèn)靜劑S構(gòu)型，消炎S構(gòu)型，擴張支氣管S構(gòu)型，抗結(jié)核病右旋體，治療高血壓,β-受體阻斷劑R構(gòu)型，鈉通道阻滯劑R構(gòu)型，療效很弱R構(gòu)型，突變劑R構(gòu)型，有神經(jīng)毒性R構(gòu)型，致畸胎R構(gòu)型，防治牙周病R構(gòu)型，抑制血小板凝集R,R構(gòu)型，致失明左旋體，舒張血管Shu-LaiLiu，DongzhiWei*,etal.,BioprocessandBiosystemsEngineering,2006(Inpress).Shu-LaiLiu，DongzhiWei*,etal.,PreparativeBiochemistry&