第十二章-色譜分析法導論課件-1

第十二章色譜分析法1第十二章色譜分析法第十二章(1)色譜分析法導論第十二章(2)氣相色譜分析法第十二章(3)高效液相色譜分析法kaishi2第十二章(1)色譜分析法導論

Chromatography31、色譜法的產生色譜法是一種分離技術，它是俄國植物學家茨維特1906年創(chuàng)立的。分離植物葉子中的色素時，將葉片的石油醚（飽和烴混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末(CaCO3有吸附能力)，用純石油醚洗脫（淋洗）。

一、色譜分析法簡介§12(1)-1概述

4Tsweet的實驗5Tsweet的實驗6（1）一種是CaCO3吸附，使色素在柱中停滯下來（2）一種是被石油醚溶解，使色素向下移動各種色素結構不同，受兩種作用力大小不同，經過一段時間洗脫后，色素在柱子上分開，形成了各種顏色的譜帶，這種分離方法稱為色譜法。色素受兩種作用力影響712-1概述色譜法中共使用兩相

固定相—固定不動的相

CaCO3

流動相—推動混合物流動的液體石油醚色譜法：混合物在流動相的攜帶下通過色譜柱分離出幾種組分的方法。流動相液體流的速度慢，加壓，使其流快，1969年HPLC發(fā)展，高壓液相色譜。氣體1952年產生氣相色譜，是色譜法一項革命性進展。812-1概述固定相：（1）固體吸附劑：CaCO3、Al2O3等（2）液體固定相（載體+固定液——高沸點有機化合物，涂在載體上）色譜分析法一定是先分離，后分析。色譜分離法一定具有兩相；固定相和流動相分離：利用組分在兩相中分配系數或吸附能力的差異進行分離。9隨著被分離樣品種類的增多，該方法廣泛地用于無色物質的分離，“色譜”名稱中的“色”失去了原有的意義，但“色譜”這一名稱沿用至今。102.色譜法的發(fā)展1930年代初：R.Kuhn把M.Tswett的方法用于類胡蘿卜素的分離，從此色譜法得以廣泛應用。1935年：科學家第一次用苯酚和甲醛合成了有機離子交換劑，能交換陽離子和有機氫離子。后來又合成了陰離子交換劑，既可用于離子交換，又用于色譜分離——即現時流行的離子交換色譜法。至1950年此方法已成型。112.色譜法的發(fā)展1938年：科學家將糊狀Al2O3漿液在玻璃板上鋪成均勻薄層，用于分離植物中的藥用成分，即今日用的薄層色譜。（用于薄層的材料已發(fā)展至多種：如硅膠、聚酰胺等）。1944年：科學家用纖維（濾紙）作固定載體，以吸附在濾紙上的水作溶劑，根據組分在兩相中溶解度不同，即滲透率（速率）不同而使各組分彼此分離，稱之為紙色譜法。121952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性載體表面涂漬一層均勻的有機化合物膜作為固定相，并以氣體為流動相，用來分離脂肪酸混合物——即今日的氣－液色譜。1952年獲諾貝爾化學獎。2.色譜法的發(fā)展1320世紀60~70年代GC-MS，GC-FTIR（傅立葉變換紅外光譜）等聯用成功，使色譜聯用技術成為分離、鑒定、剖析復雜混合物的最有效工具。20世紀60年代末，在經典液相色譜基礎上發(fā)展成高速、高效的現代液相色譜法。20世紀50~60年代是以氣相色譜為突破口的大發(fā)展時期，70年代進入以高效液相色譜為代表的現代色譜時代。80年代以來，HPLC的應用范圍、文獻數量已超過GC。2.色譜法的發(fā)展14在較長時期內，色譜法主要應用在有機分析領域。1975年，離子色譜的出現和各種金屬螯合物色譜的迅速發(fā)展，使色譜法已用于無機陰、陽離子和金屬元素的分析。20世紀70年代，計算機技術進入色譜領域，出現了計算機控制的全自動色譜儀。15我國情況我國在色譜分析領域的研究起于1954年，由中國科學院大連化學物理研究所首先開發(fā)。經過幾十年的努力，我國色譜基礎理論研究和應用技術研究方面具有特色。16國內外主要色譜雜志1.色譜（ChineseJournalofChromatography）中文色譜雜志2.JournalofChromatography（色譜雜志）1958年創(chuàng)刊，主要以英文發(fā)表。3.JournalofChromatographicScience（色譜科學雜志）1963年創(chuàng)刊4.

Chromatographia（色譜法）1968年創(chuàng)刊5.JournalofLiquidChromatography（液相色譜雜志）1978年創(chuàng)刊，主要發(fā)表液相色譜研究報告6.JournalofHighResolutionChromatographyandCommunications（高分辨色譜和色譜通訊）分析化學、分析生物化學、醫(yī)藥、食品、環(huán)境科學、石油化工等專業(yè)雜志也常發(fā)表色譜研究報告。1712-1概述3、特點：（1）分離效能高（2）靈敏度高（3）分析速度快（4）應用范圍廣18二、色譜分析法分類1、按兩相狀態(tài)分類氣相色譜—氣體作流動相

（1）氣固色譜:氣體作流動相，固體吸附劑作固定相。（2）氣液色譜:氣體作流動相，固定液作固定相。19液相色譜—液體作流動相（1）液固色譜：液體作流動相,固體吸附劑作固體相。（2）液液色譜：液體作流動相，固定液作固定相。超臨界液體色譜——超臨界流體作色譜流動相。202、按操作形式分類（1）柱色譜：

填充柱色譜—固定相填充到柱管內毛細管柱色譜—把固定相涂在毛細管內壁上，中間是空的。（2）紙色譜：濾紙為載體，吸附在濾紙上的水為固定相的色譜法，流動相是含一定比例水的有機溶劑，樣品在濾紙上展開進行分離。（3）薄層色譜：把固體固定相壓成或涂成薄膜的色譜法。二、色譜分析法分類21

3、按分離原理分類

（1）吸附色譜：利用吸附劑表面對被分離的各組分吸附能力不同進行分離。

（2）分配色譜：利用不同組分在兩相分配系數或溶解度不同進行分離。

（3）離子交換色譜：利用不同組分對離子交換劑親和力不同進行分離。

（4）凝膠色譜：利用凝膠對分子的大小和形狀不同的組分所產生的阻礙作用不同而進行分離的色譜法。

二、色譜分析法分類22§12(1)-2色譜圖及色譜常用術語一、色譜圖混合物樣品（A+B）→色譜柱中分離→檢測器→記錄下來。組分從色譜柱流出時，各個組分在檢測器上所產生的信號隨時間變化，所形成的曲線叫色譜圖。記錄了各個組分流出色譜柱的情況，又叫色譜流出曲線。232412-2概述

25二、色譜圖中的基本術語

26271、基線—在實驗操作條件下，色譜柱后沒有組分流出的曲線叫基線。穩(wěn)定情況下，一條直線?；€上下波動稱為噪音。二、色譜圖中的基本術語

282、色譜峰的高度h（1）峰高h—色譜峰最高點與基線之間的距離，可用mm,mV，mA表示。峰高低與組分濃度有關，峰越高越窄越好。

二、色譜圖中的基本術語

h293.色譜峰的寬度標準偏差—σ峰高0.607倍處的色譜峰寬的一半。二、色譜圖中的基本術語

σ30峰底寬Wb—色譜峰兩側拐點所作切線在基線上的距離

Wb

=4σ

半峰寬W1/2—峰高一半處色譜峰的寬度

W1/2

=2.354σW1/2

=0.589Wb

Wb31

4.色譜峰面積A

——色譜峰與峰底所圍的面積。對于對稱的色譜峰

A=1.065hW1/2

對于非對稱的色譜峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2二、色譜圖中的基本術語

325.色譜保留值——定性的依據

組分在色譜柱中停留的數值，可用時間t和所消耗流動相的體積來表示。組分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越強，在柱中滯留的時間越長，消耗的流動相體積越大，固定相、流動相固定，條件一定時，組分的保留值是個定值。二、色譜圖中的基本術語

335.色譜保留值——定性的依據t0（1）死時間t0——不被固定相吸附或溶解的組分流經色譜柱所需的時間。從進樣開始到柱后出現峰最大值所需的時間。氣相色譜—惰性氣體（空氣、甲烷等）流出色譜柱所需的時間。1734

組分流經色譜柱時所需時間。進樣開始到柱后出現最大值時所需的時間。操作條件不變時，一種組分有一個tR定值，定性參數。(2)保留時間tRtR35（3）調整保留時間t’R—扣除了死時間的保留時間。t’R=tR-t0又稱校正保留時間，實際保留時間。

t’R體現的是組分在柱中被吸附或溶解的時間。

二、色譜圖中的基本術語

t’R36（4）死體積V0—不被固定相滯留的組分流經色譜柱所消耗的流動相體積稱死體積，色譜柱中載氣所占的體積。V0=t0F0F0——柱后出口處流動相的體積流速mL/min保留值用體積表示：37（5）保留體積VR

—組分從進樣開始到色譜柱后出現最大值時所需流動相體積，組分通過色譜柱時所需流動相體積VR=tRF0（6）調整保留體積V’R—扣除了死體積的保留體積，真實的將待測組分從固定相中攜帶出柱子所需的流動相體積。V’R=t’RF0二、色譜圖中的基本術語

t0、V0與被測組分無關，因而t’R、V’R

更合理地反映了物質在柱中的保留情況。38（7）相對保留值γ2，1或γi,s

—在相同操作條件下，組分2或組分i對另一參比組分1或s調整保留值之比二、色譜圖中的基本術語

相對保留值只與柱溫及固定相的性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關。廣泛使用的定性數據。39三、分配平衡

在一定溫度下，組分在流動相和固定相之間所達到的平衡叫分配平衡，組分在兩相中的分配行為常采用分配系數K和分配比k來表示。K隨T變化，與固定相、流動相的體積無關=cs/cm組分在固定相中的濃度組分在流動相中的濃度K=1、分配系數K(濃度分配系數)402、分配比k(又叫容量因子，容量比)組分在固定相中的質量組分在流動相中的質量=ms/mm

=csvs/cmvm=Kvs/vm

k=k隨T、固定相、流動相的體積變化而變化k越大，組分在固定相中質量越多，tR越長組分與固定相的熱力學性質柱溫、柱壓兩相體積tR越長K有關有關無關越大k有關有關有關越大1741經實驗測得k與tR之間的關系：***tR=t0(1+k)42總結：（1）由色譜峰的數目，可判斷試樣中所含組分的最少個數。（2）根據色譜峰的保留值—進行定性分析。（3）根據色譜峰的h.A—進行定量分析。（4）根據色譜峰的間距及峰的寬度—可評價色譜的柱效及分離情況。43§12(1)-3色譜法的基本理論

在50年代，色譜技術發(fā)展的初期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經驗理論－塔板理論用于色譜分析法。44塔板理論把色譜柱比作一個分餾塔，假設柱內有n塊塔板，每塊塔板高度稱為理論塔板高度，用H表示，在每塊塔板內，試樣各組分在兩相中分配并達到平衡，最后，揮發(fā)度大的組分和揮發(fā)度小的組分彼此分離，揮發(fā)度大的最先從塔頂（即柱后）逸出。盡管這個理論并不完全符合色譜柱的分離過程，色譜分離和一般的分餾塔分離有著重大的差別，但是因為這個比喻形象簡明，因此幾十年來一直沿用。一、塔板理論4546一、塔板理論

對一個色譜柱來說，若色譜柱長度固定L，每塊塔板高度H越小，塔板數目越多，分離的效果越好，柱效越高。塔板數用n表示。

n=L/H或H=L/n

H越小，n越多，分離效果越好，用H,n評價柱效。

由塔板理論導出n與Wb

，W1/2

的關系。47

有時n大，分離效果也不好，因用tR

內含t0，后來改用有效塔板數。一、塔板理論

塔板理論的成功之處，提出了計算理論塔板高度、塔板數的公式及評價柱效的方法，具有開創(chuàng)性，但有一定局限性。H理＝Ｌ／n理H有效＝Ｌ／n有效48前面已知，用塔板理論來說明色譜柱內各組分的分離過程并不合理，因為色譜柱內并沒有塔板。當同一試樣進入同一色譜柱，當流動相速度變化時，得到不同的色譜圖。測得的

n和

H也不同，充分說明塔板理論不足以說明色譜柱的分離過程。２、速率理論—范第姆特方程

491956年，速率理論是荷蘭學者范第姆特（VanDeomter）提出的。速率理論吸收和保留了塔板理論的有益成果，n、H的概念。提出了影響板高的各種因素。此方程經簡化后寫為:該式稱為速率方程（范氏方程）。

下面我們將對公式中的各項進行討論

u為流動相線速度cm.s-1，線速度=柱長/死時間２、速率理論—范第姆特方程

50２、速率理論—范第姆特方程

（1）提出了影響Ｈ的三項因素：渦流擴散項，分子擴散項，傳質阻力項。（2）在流動相流速一定時，當Ａ、Ｂ、Ｃ最小時，Ｈ才小，n才最高，柱效高。當Ａ、Ｂ、Ｃ最大時，Ｈ才大，n才最小，柱效低。1751（1）渦流擴散項A在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴散。5253（1）渦流擴散項A

A＝2λdpA與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關。

減?。粒汗潭ㄏ囝w粒應適當細小、均勻；填充要均勻。

54（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）

待測組分是以“塞子”的形式被流動相帶入色譜柱的，在“塞子”前后存在濃度梯度，由濃→稀方向擴散，產生了縱向擴散，使色譜峰展寬。5556

B＝2γDγ——是填充柱內流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了填充物對分子擴散的阻礙程度。通常小于1的常數。

D——為組分在流動相中擴散系數(cm2·s-1)。

Dg氣相擴散系數比液相擴散系數Dm大的多（約105倍），在液相中分子縱向擴散引起峰變寬很小，可忽略不計，在氣相中，當載氣流速小時分子擴散較大。（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）

57減小縱向擴散項Ｂ／u采取措施：①適當提高流動相流速u，減小保留時間②用相對分子質量較大的氣體作流動相。

Dg∝B＝2γDg

③適當降低柱溫Ｔc（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）

B/u＝2γD/u58（3）傳質阻力項Cu傳質阻力系數包括兩部分Ｃ＝Ｃm+Cs兩項組成Cm—流動相傳質阻力系數組分從流動相移動到固定相表面進行兩相之間的質量交換時所受到的阻力，質量交換慢，引起色譜峰變寬。59Cs-—固定相傳質阻力系數即組分從兩相界面移動到固定相內部，達分配平衡后，又返回到兩相界面，在這過程中所受到的阻力為固定相傳質阻力。（3）傳質阻力項Cu組分在固定相中擴散系數固定液膜厚度6061①采用粒度小的填充物Cm∝dp2

②相對分子質量小的載氣，Dg大。

Cm∝1/Dg

③降低固定液液膜厚度(Cs∝df2)并且液膜要均勻；若膜厚，擴散，費時；但不能太薄，否則包不住載體。④Ds越大越好，增加柱溫是提高Ds的方法之一。（3）傳質阻力項Cu減小Ｃ采取措施：62***為提高柱效，Ｈ小，應注意以下幾點：１）采用適當小而均勻的載體，柱填充應均勻。２）固定液液膜薄而均勻，并且不宜流失。３）載氣流速小的時候，Ｂ／u是影響Ｈ的主要因素，選Ｍr大的載氣，Ｎ２；

載氣流速大的時候，Cu是影響Ｈ的主要因素，選Ｍr小的載氣，H2，Ne４）采用適當的柱溫。

氣相色譜

63液相色譜

Dm比Dg小4-5個數量級，分子擴散項可以忽略不計為提高柱效，Ｈ小，應注意以下幾點：１）減小填料粒度dp。２）在一定范圍內采用低流速流動相３）用低黏度溶劑做流動相

4）適當提高柱溫64HuGC（a）LC（b）GC（a）——u有一最低點u最佳；u小或u大，H都大LC（b）——u沒有最低點；u大，H增大不多，因此可用較高的流速，提高分析速度。65可測三種流速對應的板高H，解三元一次方程，求出A、B、C即可求出u最佳和H最小。實際工作中，為縮小分析時間，可選略高u最佳的流速，常用２u最佳。GC中最佳流速可通過實驗和計算方法求得將微分后求得66二、色譜基本分離方程１、分離度Ｒ——色譜柱的總分離效能指標

定義：相鄰兩個峰的保留值之差與兩峰寬度平均值之比式中：分子反映了溶質在兩相中分配行為對分離的影響，是色譜分離的熱力學因素。分母反映了動態(tài)過程溶質區(qū)帶的擴寬對分離的影響，是色譜分離的動力學因素。從中得到：兩溶質保留時間相差越大，色譜峰越窄，分離越好。67討論：色譜分離中的四種情況的討論：①柱效較高，△K(分配系數)較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。68兩個峰tR相差越大，W越窄，Ｒ值越大，說明柱分離較能高。Ｒ≥１.5兩個組分能完全分開。Ｒ＝１.0兩組分能分開，滿足分析要求。Ｒ＜１.0兩峰有部分重疊。6970例題已知物質A和B在一根30.00cm長的柱上的保留時間分別為16.40min和17.63min。不被保留組分通過該柱的時間為1.30min。峰底寬度分別為1.11min和1.21min，計算：（1）柱的分離度；（2）柱的平均塔板數；71題

解（2）柱的平均塔板數

n=16(tR/Wb)2=16(16.40/1.11)2=3493n=16(tR/Wb)2=16(17.63/1.21)2

=3397n平均=（3493+3397）/2=3445解：（1）柱的分離度72２、分離度與柱效能，選擇性的關系

柱效能—指色譜柱在分離過程中的分離效能，常用n，Ｈ來描述，n越大，Ｈ越小，柱效越高，對單個組分而言。對多個組分的分離來說，無法用n,H來描述，n大，Ｈ小，幾個峰未必分的開。選擇性—描述兩個相鄰組分在同一固定相中熱力學分布行為的重要參數，用r2,1相對保留值表示.r2,1越大，保留時間相差大，分離越好（但未考慮峰寬因素）73２、分離度與柱效能，選擇性的關系

74∵n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2

２、分離度與柱效能，選擇性的關系

∴75r2,1，k，N∶如何控制分辨率?r2,176a:柱效項：塔板數決定，n越大，柱效越高分離的越好。若通過增加柱長來增加n,tR會增大，降低板高才是增大R最好的辦法２、分離度與柱效能，選擇性的關系

b：選擇性項：r2,1的微小變化，使分離度有較大改善，r2,1越大，tR’（２）與t’R（1）相差越大，分的越好。r2,1=1的兩組分無法分離。C：柱容量項：k大一些對分析有利;太大，tR長，柱容量合適,分的才好。一般１＜k＜１０（2-7)77以n有效表示，則有：78例題：

在一定條件下,兩個組分的調整保留時間分別為85秒和100秒,要達到完全分離，即R=1.5。計算需要多少塊有效塔板?若填充柱的塔板高度為0.1cm,柱長是多少?L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm

即柱長為1.55米時，兩組分可以得到完全分離。解：r2,1=100/85=1.1879§12—4色譜定性和定量分析一、定性分析定性分析的任務是確定色譜圖上各個峰代表什么物質。

1.利用保留值與已知物對照定性（1）利用保留時間定性在相同色譜條件下，將標準物和樣品分別進樣，兩者保留值相同，可能為同一物質。此方法要求操作條件穩(wěn)定、一致，必須嚴格控制操作條件，尤其是流速。8081

（2）利用峰高增量定性若樣品復雜，流出峰距離太近，或操作條件不易控制，可將已知物加到樣品中，混合進樣，若被測組分峰高增加了，則可能含該已知物。（3）利用雙色譜系統(tǒng)定性

通過改變色譜條件來改變分離選擇性，使不同物質顯示不同保留值。例：選用極性差別較大的兩種不同固定液來制備色譜柱，不同物質具有不同保留值。2.利用保留值經驗規(guī)律定性（氣相）3.根據文獻保留值數據定性（氣相）824.與其它分析儀器聯用的定性方法小型化的臺式色質聯用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯用儀；組分的結構鑒定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD83二、定量分析

氣相色譜定量分析是根據檢測器對溶質產生的響應信號與溶質的量成正比的原理，通過色譜圖上的峰面積或峰高，計算樣品中溶質的含量。mi=fi

Ai

mi=fihi

mi—被測組分i的質量，fi—比例系數Ai、hi—被測組分的峰面積及峰高A=1.065×h×W1／2A=1.065×h（W0.15＋W0.85）/2841、定量校正因子

色譜定量分析是基于峰面積與組分的量成正比關系。

但由于同一檢測器對不同物質具有不同的響應值，即不同物質檢測器的靈敏度不同，相同的峰面積并不意味著有相等的量。

定量校正因子：單位峰面積對應組分的質量。

fi=mi/Aifi絕對校正因子(1)絕對校正因子絕對校正因子受操作條件影響較大，要嚴格控制色譜條件，不易準確測定，沒有統(tǒng)一標準，無法直接引用，定量分析中采用相對較正因子。mi=fiAi85（2）相對校正因子**

用一個標準，把所有組分的A較正到標準物的A上，在同一標準上進行比較計算，熱導檢測器常用苯作標準。

相對定量校正因子fi′定義：樣品中某組分的絕對校正因子與基準物的絕對校正因子之比。

fi′

(m)表示相對質量校正因子86也可用相對摩爾校正因子fi(M)（2）相對校正因子凡文